摘要
柑橘黄龙病是柑橘毁灭性病害，而柑橘木虱Diaphorinacitri是柑橘黄龙病田间自然传播的媒介昆虫。柑橘木虱取食时会将唾液蛋白注入柑橘韧皮部，由于唾液蛋白与韧皮部细胞直接接触，唾液蛋白可能调控柑橘的防御反应。本论文从前期柑橘木虱唾液蛋白组中筛选了小分子蛋白DcSP8,利用RT-qPCR分析了DcSP8时空表达和不同取食的诱导表达;利用免疫荧光和免疫印迹分析了DcSP8在昆虫体内的定位情况;通过RNAi干扰分析DcSP8对柑橘木虱存活的影响;利用DcSP8作为诱饵蛋白筛选出与柑橘互作的蛋白，并通过酵母双杂和BIFC进行蛋白互作验证;通过本氏烟草表达系统成功过表达DcSP8,分析植物激素和抗性相关基因表达情况。以上研究为后续深入研究柑橘木虱唾液蛋白调控柑橘防御反应奠定基础。本论文主要研究结果如下: (1)基于RT-qPCR分析，DcSP8在柑橘木虱唾液腺特异性高表达，在木虱取食生活阶段(若虫和成虫)显著高于非取食阶段(卵);柑橘木虱在无取食、取食人工饲料、取食寄主植物九里香的状态下，DcSP8在取食人工饲料和九里香组的表达量显著高于无取食组。经免疫荧光定位和免疫印迹Westernblot分析DcSP8主要表达于柑橘木虱唾液腺。 (2)利用夹膜法对柑橘木虱唾液蛋白DcSP8进行RNA干扰，以分析其对柑橘木虱成虫的存活影响，结果显示饲喂dsRNA在第3d中有效降低DcSP8的表达量，而DcSP8表达量下调导致柑橘木虱成虫5d内的死亡率明显上升。 (3)以DcSP8为诱饵蛋白，从柑橘(甜橙)酵母双杂文库筛选出12个与DcSP8具有潜在互作关系的蛋白。进一步利用酵母双杂和BIFC验证发现DcSP8与柑橘转录因子NAC078存在互作。启动子结合基序预测显示NAC078具有多个可与植物黄酮类化合物合成途径关键酶启动子序列结合的基序。 (4)通过本氏烟草瞬时表达DcSP8,亚细胞定位表明DcSP8定位于本氏烟草的细胞核与细胞质;本氏烟草过表达DcSP86d后，可导致茉莉酸(JA)含量的显著减少和JA信号途径下游病程相关蛋白(PR)基因PR4表达量的显著性下降;过表达DcSP8对水杨酸(SA)含量不产生影响，但过表达6d后能引起SA信号途径下游基因PR1表达量的下降;过表达DcSP86d后引起了苯丙氨酸解氨酶基因PAL和查尔酮合成酶基因CHS表达量下降;过表达DcSP83d后引起胼胝质合成相关基因CalS12表达量较对照组显著性下降。 综上所述,本论文结果表明柑橘木虱唾液蛋白DcSP8能调控植物防御反应，其中可能通过与植物转录因子NAC078互作而调控了植物黄酮类化合物合成途径。
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