摘要
食管癌的发病率与死亡率在全球都呈现惊人的上升趋势，尤其是中国。中国食管癌患者常见的病理类型为食管鳞癌（esophagealsquamouscellcarcinoma,ESCC），早期五年生存率高达90%以上，但诊断时常为中期或晚期，导致总生存率低。全面而有效的控制高死亡率，除了精进治疗手段外，还需其他方面的配合。使用特异性的生物标志物被认为是目前诊断和靶向治疗最有前景的治疗方式，研究揭示RNA、蛋白和代谢物都能成为生物标志物用于肿瘤的诊断、治疗或预后。为了筛选和研究能够用于食管鳞癌的生物标志物及调控机制，本研究以210对肿瘤和正常食管组织为试验材料，主要通过内参基因的选择、转录组学测序和代谢组学检测及多组学联合的办法，分析肿瘤与正常组织的差异，从转录层面揭示ESCC发生的ceRNA调控机制,并使用qRT-PCR、核质分离、双荧光素酶报告基因、ROC曲线等手段对显著差异表达基因和ceRNA网络验证。同时，通过HPLC-TOF-MS和多组学联合分析对两种组织差异代谢物及通路进行鉴定分析。本试验主要研究结果如下： (1)食管鳞癌组织内参基因稳定性评估结果：对八种候选内参基因进行大样本个体qRT-PCR，使用五种评估软件进行基因表达稳定性排序，结果发现PPIA与RPS18相对稳定，GUSB表达较不稳定，表明食管鳞癌组织基因表达水平验证时，可优先选择PPIA或RPS18或两者联合使用，为检测目的基因在食管鳞癌组织的表达规律提供必要的校正依据。 (2)全转录组学测序获得食管鳞癌和配对正常食管组组织样本的差异表达RNA及功能富集：其中，差异mRNA有8549个、差异miRNA有226个、差异lncRNA有1178个、差异circRNA有625个，说明食管组织在癌变之后转录水平变化明显。进一步对表达量筛选后得到共4394个mRNA（DETs），GO分析结果表明DETs主要是参与吞噬作用，识别等生物学过程；KEGG富集结果显示DETs主要参与代谢途径、癌症的转录失调及蛋白聚糖通路等过程，表明大多数通路与食管消化作用及癌症密切相关。随机挑选30个RNA进行qRT-PCR来验证测序数据，结果显示趋势一致。同时，提高表达量及FC值设置后有112个基因在两组间显著差异表达，其中20个上调，102个下调，有BPIFB2、COL1A1、MMP11等，为食管鳞癌的早期诊断和个性化治疗提供候选的分子标志物提供理论基础。 (3)生物信息学分析全转录组数据获得基于lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA调控网络：经典预测软件（miRanda、TargetScan、RNAhybrid）得到10675个mRNA-miRNA及667个lncRNA-miRNA差异表达关系对，基于表达关联及相关性分析筛选得到一个包括13个lncRNA、24个miRNA和70个mRNA的ceRNA调控网络。KEGG功能分析发现主要参与癌症代谢途径与信号传导通路；GO富集显示作用于细胞粘附、活化T细胞增殖的正向调控等生物过程，推测此网络与食管鳞癌的发展进程关系密切。同时，定量结果与测序趋势一致，实验发现lncRNA分布以细胞质为主，ceRNA调控网中不仅mRNA与lncRNA表达正相关，与miRNA表达负相关，并且lncRNA与mRNA野生型质粒相较突变组相对荧光素酶活性显著下降，证实靶RNA与miRNA具有物理结合，说明ceRNA网络预测可靠性，且首次在食管鳞癌中证明lncRNA-H19-hsa-miR-766-3p-MMP2和lncRNANONHSAT072269.2-has-miR-378c-SKP2调控轴的可能性。用172对样本的基因相对表达量进行ROC曲线分析网络中核心基因MMP2、SKP2的诊断潜力，发现AUC均大于0.5，联合使用时诊断效能更高，具有一定诊断敏感性和特异性，可作为诊断的潜在基因标志物。 (4)运用HPLC-TOF-MS检测食管鳞癌组织和正常食管组织的代谢物含量及表达变化情况：共鉴定出659个代谢物，通过差异分析共得到肿瘤组表达上调的164个和下调的105个有名称的差异代谢物，其主要参与癌症中的胆碱代谢、鞘脂代谢等生物代谢通路和鞘脂、神经活性配体-受体相互作用等信号通路。再通过显著表达差异筛选和ROC曲线分析能够用于区分肿瘤和正常组的潜在标志物，发现十二个内源性显著差异代谢物，如CytochalasinPpho、JanthitremG等，标志着这些代谢产物的变化与食管鳞癌有一定关联，为代谢物靶向治疗提供了理论解释。 (5)食管鳞癌组织多组学联合分析；整合分析差异表达的基因、代谢物，构建共同富集pathway和多分子调控互作网络图。结果显示，肿瘤形成后，具有高关联的差异基因和代谢物有40和227个，且调控关系复杂。KEGG共富集结果发现主要共同参与调控的信号通路有蛋白质的消化与吸收、神经活性配体-受体相互作用等，富集到的关键差异代谢物及基因可能是导致食管组织癌变的因素，例如，COL1A1基因在转录组测序中显著高表达，被富集在蛋白质消化与吸收差异代谢通路中，同时在相关性网络分析结果中也与11''-Carboxy-gamma-chromanol等差异代谢物显著关联，这为临床食管鳞癌诊断分子、治疗靶点等筛选提供了理论依据和作用机制研究模型。 上述结果获得了食管鳞癌与正常组织显著差异基因及代谢差异物，可作为食管鳞癌诊断的候选生物标志物；揭示了与食管鳞癌紧密相关的ceRNA调控机制，初步证明了网络中lncRNA-H19-hsa-miR-766-3p-MMP2和lncRNANONHSAT072269.2-has-miR-378c-SKP2两条调控轴的可靠性；并在基因-代谢物相互关联的生物学效应机制提供理论基础，但关键候选基因与代谢物的具体功能和调控机理还需进一步研究，其参与关键通路的作用需要实验深入验证。
NETL