摘要
背景 急性心肌梗死发病率、致残率、致死率均较高，随着医疗水平的不断进步，接受直接PCI患者的比例逐年提高。但在手术过程中，心肌缺血/再灌注损伤（IschemiaReperfusionInjury，IRI）会加重心肌细胞受损，甚至会造成恶性心律失常，引起心脏衰竭，因此需要解决的重要临床问题是有效降低IRI。关于IRI的机制研究已有大量的科研理论和临床数据，然而针对这些病理生理过程的治疗效果却不尽如人意。这从反面进一步证明目前的研究尚未完全阐明心肌IRI的全部机制，关于IRI的研究将一直是医学领域研究的热点和难点。最近的研究表明，铁死亡参与了心肌IRI，但具体机制还不明确。经典的铁死亡信号调控通路是由谷酰甘肽过氧化物酶（Glutathioneperoxidase4，GPX4）介导的，而铁死亡抑制蛋白（FerroptosissuppressorProtein1，FSP1）则是在2019年被发现的，FSP1是一种新型的抗氧化蛋白，它能够减轻细胞内氧化应激反应，保护细胞免受自由基的攻击。如果该蛋白在细胞内的表达水平显著上升，将会使细胞铁死亡概率大幅减少，这也是当前发现的第一个可以对GPX4缺失起到补偿作用的酶催化系统。基于上述研究背景提出科学假设：急性心肌梗死时，在进行血流再通后，由于缺血缺氧等危险因素作用于心肌细胞，抑制铁死亡通道中重要调控因子FSP1的表达，促进心肌细胞铁死亡，加重了心肌细胞IRI的发生。 目的 本研究旨在探索FSP1在心肌缺血再灌注损伤所致铁死亡中的作用机制。 方法 1.构建H9C2心肌细胞缺氧/复氧（Hypoxia/Reoxygenation,H/R）模型以模拟体内IRI，通过CCK8法检测细胞增殖，乳酸脱氢酶（LacticDehydrogenase，LDH）细胞毒性检测试剂盒检测细胞膜完整性。 2.将H9C2心肌细胞分为以下三组：Control组（正常细胞）、H/Rmedium组（缺氧/复氧细胞）、H/Rmedium+铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1，Fer-1）组（缺氧/复氧细胞加入Fer-1）。Westernblotting法检测H9C2心肌细胞中GPX4、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（Acyl-CoASynthetaseLong-chainfamilymember4，ACSL4）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1（NicotinamideAdenineamp;nbsp;DinucleotidePhosphateOxidase1，NOX1）、环氧化酶2（Cyclooxygenase-2，COX2）等经典铁死亡相关蛋白表达。 3.将H9C2心肌细胞分为以下三组：Control组（正常细胞）、H/Rmedium组（缺氧/复氧细胞）、H/Rmedium+Fer-1组（缺氧/复氧细胞加入Fer-1）。用铁试剂盒测定细胞总铁和Fe2+水平，免疫荧光法观察线粒体MitoSOX水平，流式细胞仪检测LipidROS水平。 4.构建H9C2心肌H/R模型，分别转染FSP1siRNA（Knockdown，KD）和FSP1过表达（overexpression，OE）质粒至H9C2心肌细胞中，Westernblotting法检测缺氧/复氧刺激及质粒转染后细胞中FSP1蛋白表达，进一步构建FSP1过表达或敲低H9C2心肌细胞模型。 5.将H9C2心肌细胞分为以下四组：NC组（正常细胞）、H/Rmedium组（缺氧/复氧细胞）、H/Rmedium+FSP1OE组（将FSP1OE质粒转染至缺氧/复氧细胞中）和H/Rmedium+FSP1KD组（将FSP1KD质粒转染至缺氧/复氧细胞中），通过CCK8法检测细胞增殖，LDH试剂盒检测细胞毒性，铁试剂盒测定细胞总铁及Fe2+水平，流式细胞仪检测LipidROS水平。 结果 1.H9C2心肌H/R后细胞活力下降，细胞毒性明显增加，验证H/R模型构建成功。 2.H9C2心肌H/R后经典铁死亡相关蛋白GPX4表达减少，ACSL4、NOX1、COX2表达增加，Fer-1能够抑制H/R诱导的上述铁死亡相关蛋白的变化，提示铁死亡的发生。 3.H9C2心肌细胞H/R后细胞Fe2+，总铁、MitoSOX、LipidROS水平均明显升高，而Fer-1能明显抑制H/R诱导的Fe2+，总铁、MitoSOX、LipidROS水平升高，进一步证实了铁死亡的发生。 4.H9C2心肌细胞H/R后FSP1表达减少，与缺氧/复氧组相比，转染FSP1OE质粒后，心肌细胞FSP1蛋白表达水平明显增加，而转染FSP1KD质粒后，心肌细胞FSP1蛋白表达水平下降，进一步验证FSP1过表达或敲低细胞模型构建成功。 5.过表达FSP1降低H/R诱导的细胞毒性，增加细胞活力；敲低FSP1增加H/R诱导的细胞毒性，减少细胞活力。 6.过表达FSP1降低H/R诱导的细胞Fe2+、总铁、LipidROS水平，即抑制铁死亡发生；敲低FSP1增加H/R诱导的细胞Fe2+，总铁、LipidROS水平，即促进铁死亡发生。 结论 研究结果表明缺氧/复氧可以通过降低H9C2心肌细胞FSP1表达，促进铁死亡的发生。
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