摘要
副猪嗜血杆菌(G.parasuis,GPS)作为猪场常见的条件致病菌，可以定殖于猪的上呼吸道，是引起Gl?sser氏病的病原体，同时也是引起猪呼吸道疾病复合体(PRDC)的主要病原体之一。当宿主处于应激状态或免疫力低下时，G.parasuis能够突破呼吸道上皮组织的物理屏障，进入黏膜下层组织从而引起全身感染，感染急性期以多发性的关节炎和浆液炎为主，慢性症状则会出现肺脏、心脏等组织的纤维化，严重影响猪只的生长速度。然而，目前关于G.parasuis跨越呼吸道上皮物理屏障策略的研究较少，同时G.parasuis定殖引起呼吸道上皮细胞损伤的作用机制尚不明确。此外，近几年关于G.parasuis与其他呼吸道病原体的混合感染的检出率增高，其中G.parasuis与PRRSV的混合感染是各国流行性调查研究中最常被检出的混合感染形式之一，给养猪业造成严重经济损失。但是目前关于G.parasuis与PRRSV在呼吸系统中的混合感染协同致病机制仍不清楚，这给猪场疾病的防控造成很大困扰。由于关于G.parasuis与PRRSV的混合感染研究在体内和体外水平上取得的结论差异较大，因此建立能够模拟呼吸道微环境的体外混合感染模型，将为G.parasuis与PRRSV在呼吸系统中的混合感染协同致病机制研究提供重要的研究手段。 本研究通过比较G.parasuis血清3型和5型突破上皮物理屏障的组织侵入能力，探究G.parasuis诱导呼吸道上皮细胞损伤机制。利用血清3型菌株(G.parasuis81-3)和血清5型菌株(G.parasuis80-5),分别在小鼠体内、猪肺组织精细切片(PCLS)和猪高度分化的呼吸道上皮细胞中进行感染实验，从体内水平、组织水平和细胞水平对G.parasuis81-3和G.parasuis80-5感染诱导的细胞毒性作用和损伤机制进行系统评价。首先利用C57小鼠进行致病性试验，评估G.parasuis81-3和G.parasuis80-5在小鼠体内的毒力差异;此外,建立了G.parasuis在PCLS上的感染模型，评价了不同菌株在肺脏的毒力作用;在此基础上，进一步建立了G.parasuis在高度分化的上皮细胞表面感染模型，深入探究G.parasuis81-3和G.parasuis80-5在上皮细胞中的侵入模式，并解析了G.parasuis破坏上皮细胞屏障作用和引起上皮组织损伤的分子机制。另外，建立了由高度分化的气管上皮细胞(wdPTEC)和猪肺泡巨噬细胞(PAMs)组成的共培养细胞模型(Co-ALI),并以此为研究基础，解析了G.parasuis和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)在呼吸系统混合感染的协同致病机制。通过以上研究获得实验结果如下: (1)G.parasuis81-3和G.parasuis80-5有明显的毒力差异，G.parasuis80-5菌株能够引起更强烈的炎性反应和呼吸系统的病理损伤，造成更广泛的纤毛上皮细胞脱落，引起更严重的细胞毒性及呼吸道上皮物理屏障破坏作用。 (2)G.parasuis能够在气液培养体系中极性化上皮细胞上粘附并增殖，其中上呼吸道的上皮细胞更有利于G.parasuis的定殖，而下呼吸道上皮细胞对G.parasuis引起的细胞毒性更敏感。 (3)G.parasuis在极性化的上皮细胞中感染特性研究表明，G.parasuis80-5通过调控wdPTEC中细胞连接ZO1、Claudin3、Occludin和E-cadherin转录和蛋白水平，增大wdPTEC上皮细胞间距，促进菌体跨越呼吸道屏障作用，而G.parasuis81-3主要影响wdPTEC的紧密连接蛋白表达，使菌体侵入上皮组织。 (4)转录组测序和相关蛋白表达结果表明G.parasuis能够调控与细胞连接功能和多种凋亡通路相关基因和蛋白的表达，利用TNFα-/-小鼠和Fas-/-小鼠进一步验证了由G.parasuis感染诱导上皮细胞产生的TNFα是调控上皮细胞间细胞连接作用的关键因子，并且G.parasuis能够分别通过TNFα/TNFR1和Fas/FasL两种外源性凋亡途径调控上皮细胞发生细胞凋亡。 (5)通过G.parasuis和HP-PRRSV在Co-ALI体系中的混合感染研究，分析了PAMs极化调控因子的转录和蛋白水平变化，结果表明在混合感染中HP-PRRSV能够抑制G.Parasuis介导的PAMs向M1型极化水平，促进PAMs向M2型极化。 (6)在混合感染中，G.Parasuis在上皮细胞表面的增殖能力显著增强，通过G.Parasuis调控的上皮细胞间紧密连接复合物表达，能够促进HP-PRRSV跨越呼吸道上皮细胞物理屏障。 综上所述，G.parasuis81-3和G.parasuis80-5在小鼠体内、PCLS和猪呼吸道上皮细胞中表现出差异显著的毒力作用，G.parasuis能够通过刺激上皮细胞分泌TNFα等炎性因子影响上皮细胞间细胞连接的作用和功能，其中G.parasuis80-5对粘附连接的破坏性更强使上皮细胞间隙扩大，增强G.parasuis跨越呼吸道上皮组织的能力，同时G.parasuis能分别通过TNFα/TNFR1和Fas/FasL两种外源性细胞凋亡通路诱导呼吸道上皮细胞发生凋亡。利用G.parasuis81-3和HP-PRRSV在Co-ALI体系中的混合感染模型，阐明了G.parasuis81-3通过趋化因子调控PAMs极化并干扰上皮细胞间紧密连接作用，促进HP-PRRSV的复制和跨越呼吸道屏障的能力。本研究结果为G.parasuis在猪呼吸系统致病机制研究提供了数据支持，为G.parasuis和PRRSV在呼吸系统中的混合感染致病机制的深入研究提供理论基础，同时为猪呼吸系统混合感染模型的优化提供新思路。
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