摘要
甲萘醌-7（menaquinone-7,MK-7）是一种人体正常生理活动所必需的脂溶性维生素，在预防骨质疏松症、心血管疾病和肝癌等方面具有重要作用，在食品和医药行业具有广阔的应用前景。本研究主要通过菌种改造和发酵优化两个方面提升解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）中MK-7合成水平。首先通过两轮常压室温等离子体（atmosphericandroomtemperatureplasma,ARTP）诱变和原生质体融合并结合结构类似物抗性平板进行MK-7高产菌的筛选；然后通过优化摇瓶发酵培养基成分，进一步提升MK-7的产量；最后在5L发酵罐上进行补料分批发酵，并对发酵条件进行初步优化，进一步提高重组菌株的MK-7生产潜力。主要研究结果如下： （1）通过ARTP诱变和原生质体融合提升出发菌株H.β.D.R.-5的MK-7生产能力。通过ARTP诱变获得分别具有磺胺胍、1-羟基-2-萘甲酸和甲萘醌抗性突变株（分别为Ba-1.1、Ba-1.2和Ba-1.3），其MK-7产量分别比出发菌株H.β.D.R.-5（31.12±1.40mg·L-1）提升了24.45%、29.11%和12.4%。以突变株Ba-1.1、Ba-1.2和Ba-1.3为亲本菌株，通过原生质体融合获得一株同时具有上述三种抗性的重组菌株Ba-2，其MK-7产量达到了51.07±1.63mg·L-1，相比原始菌株H.β.D.R.-5提升了64%。 （2）通过新一轮ARTP诱变和原生质体融合提升菌株Ba-2的MK-7生产能力。首先通过ARTP诱变获得分别具有β-氟丙酮酸敏感型、2-脱氧-D-葡萄糖和利福平抗性突变株（分别为Ba-3.1、Ba-3.2和Ba-3.3），其MK-7产量分别比出发菌株Ba-2提升了16.51%、25%和8.22%。以菌株Ba-3.1、Ba-3.2和Ba-3.3为亲本菌株，通过原生质体融合获得一株同时具有上述三种遗传特性的重组菌株Ba-4，其MK-7产量达到了73.57±1.61mg·L-1，相比原始菌株H.β.D.R.-5提升了1.36倍。 （3）优化菌株Ba-4的摇瓶发酵培养基成分。首先，利用单因素实验探究发酵培养基中氮源、碳源、戊烯醇和表面活性剂对菌株Ba-4生长和MK-7合成的影响。随后，利用响应面法探究大豆蛋白胨、甘油和Tween-80的浓度对MK-7产量的影响。优化后的培养基组成：甘油60.08g·L-1、葡萄糖2.5g·L-1、大豆蛋白胨111.53g·L-1、酵母浸膏10g·L-1、NaCl3g·L-1、K2HPO46g·L-1、异戊烯醇10mmol·L-1、Tween-803.33g·L-1。在此条件下，摇瓶发酵144h可产生95.03±1.01mg·L-1的MK-7，较优化前提升了29%。 （4）使用5L发酵罐进行补料分批培养，并对发酵条件参数进行优化。研究结果表明，大豆蛋白胨初始浓度控制在50g·L-1，将剩余60g·L-1等分成两份分别在发酵第24h和第48h一次性泵入发酵罐内，并结合使用泡沫回流装置，对菌株Ba-4产MK-7最有利。在此条件下，通过补料分批培养，最终MK-7产量达到了215.3mg·L-1，相比优化前提升了11.2%。
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