摘要
研究目的 本研究通过网络药理学方法探讨抗病毒颗粒(KBDG)干预甲型流感的化学成分、作用靶点和信号通路，并在甲型流感病毒(IAV)感染小鼠模型中检测KBDG对IAV感染小鼠的保护作用及免疫调节机制，用来阐释KBDG在甲型流感中的疗效，以及在调节免疫应答方面可能存在的机制，为临床使用甲型流感药物提供实验依据。 研究方法 1.通过TCMSP数据库检索KBDG组方药物的化学成分，以OB和DL为条件筛选潜在的活性成分，再利用TCMSP的靶点预测功能收集潜在活性成分的作用靶点。检索GeneCards、DisgeNet、TTD、DrugBank数据库，和GEO数据库中5个芯片GSE27131、GSE35473、GSE48466、GSE66486和GSE68849的数据，使用GE02R在线分析工具筛选甲型流感的差异基因(DEGs)。取药物靶点、疾病靶点和疾病差异基因相交，交集数据利用String数据库建立蛋白质相互作用网络，通过DAVID数据库对交集靶点进行GO和KEGG富集分析，通过Cytoscape3.7.2软件构建中药-活性成分-关键靶点-通路-疾病网络，并进行网络拓扑分析。 2.选取4周龄SPF级ICR小鼠，雌雄各半，体重15-17g,随机分为空白组、模型组、阳性药组、KBDG低剂量组、KBDG中剂量组、KBDG高剂量组，每组10只，分笼饲养。适应性饲养3天后，用3％异氟烷麻醉小鼠，以15个LD50甲型流感病毒A/PuertoRico/8/34(PR8)株病毒液滴鼻感染(35μL/只)除空白组以外的5组小鼠，空白组以等量的双蒸水溶液滴鼻。造模2小时后，按分组方式灌胃给药。将药物溶于PBS中，阳性药组予奥司他韦40mg/kg/d,KBDG低剂量组予KBDG1755mg/kg/d、KBDG中剂量组3510mg/kg/d、KBDG高剂量组7020mg/kg/d,空白组和模型组给与等容积的双蒸水溶液，按照20ml/kg/d剂量给药，每天1次，连续5天。每日在同一时间观察各组小鼠的一般生存状况，实验第5天，称量小鼠的体重，并于给药2小时后，用3％异氟烷麻醉处死小鼠，解剖肺、脾脏等样本，称肺质量，左肺上叶用4％多聚甲醛溶液浸泡，用于病理切片检测，其余肺组织保存于-80℃冰箱中，新鲜脾组织制备单个核细胞悬液。采用HE染色观察小鼠肺组织病理变化，采用流式细胞术检测小鼠脾组织Th17/Treg细胞比例变化，采用实时荧光定量(Quantitativerealtimefluorescencepolymerasechainreaction,RT-qPCR)检测小鼠肺组织病毒载量、炎性因子和Th17信号通路相关基因表达，采用蛋白质印迹实验(WesternBlot,WB)检测小鼠肺组织炎性因子和Th17信号通路相关蛋白表达。 研究结果 1.KBDG干预甲型流感的生物信息学分析结果 KBDG共获得74个活性成分信息和260个药物作用靶点信息，与1379个甲型流感疾病靶点和6586个疾病差异基因之间，有IL-6、IL-1β、TNF、IFNG、TGF-β等64个共同作用靶点。将这64个关键靶点进行生物富集分析，发现其涉及的主要分子功能是酶结合、细胞因子活性、蛋白结合等，主要生物过程是凋亡调控、基因表达正调控、低氧反应等，主要细胞组成是细胞外隙、胞外区、分子复合物等，主要涉及的免疫系统信号通路是白细胞介素-17信号通路(IL-17)、c型凝集素受体信号通路、Th17细胞分化等，预测的上游激活靶点是FSRRA、IGFBP3、tamoxifen和SLC22A5,上游抑制靶点是EP300、STAT5A、MIR-155、vitaminE和ATF2,主要生物功能是炎症反应、器官损伤和异常、细胞死亡和存活等。在中药-活性成分-关键靶点-通路-疾病网络中，具有重要调节作用的活性成分是槲皮素、山奈酚、汉黄芩素等。 2.KBDG干预甲型流感的动物实验结果 (1)一般状态:IAV感染后，除空白组外，各组小鼠均表现出不同程度的流感样症状。模型组小鼠出现食量下降、弓背蜷缩发抖、皮毛枯槁耸立、精神萎靡、活动度降低等典型流感症状;阳性药组小鼠食量稍有减少，皮毛色泽暗淡，精神、活动度均尚可，无明显弓背蜷缩、抖动抽搐症状;相对比模型组，KBDG各组小鼠食量较好，弓背蜷缩发抖症状有所改善，皮毛暗淡耸立，精神、活动度尚可。 (2)体重:除空白组(23.28±1.03)外，各组小鼠感染病毒后体重均不同程度减轻。模型组(17.79±0.72)体重较空白组降低，有统计学意义(P＜0.01);与模型组比较，阳性药组小鼠体重(21.11±1.23)升高(P＜0.01);KBDG各组小鼠体重较模型组有所回升(P＞0.05)。 (3)肺指数:除空白组(0.61±0.04)外，各组小鼠肺指数均不同程度升高。与空白组比较，模型组(1.04±0.07)肺指数升高最多(P＜0.01);与模型组比较，阳性药组小鼠肺指数(0.84±0.1)降低(P＜0.01);KBDG低剂量组降低不明显(P＞0.05),中、高剂量降低具有统计学意义(P＜0.05)。 (4)病理改变:与空白组相比，模型组小鼠肺损伤评分显著升高(P＜0.01);与模型组相比，KBDG组和阳性药组肺损伤评分降低(P＜0.01);与阳性药组相比，KBDG低、中、高剂量组肺损伤评分较低，但差异无统计学意义(P＞0.05)。 (5)病毒载量:空白组小鼠未感染流感病毒，故肺组织病毒载量为零。与空白组相比，模型组小鼠病毒载量(1.01±0.1)明显升高(P＜0.01)。与模型组相比，阳性药组(0.37±0.35)与KBDG低剂量组(0.61±0.34)、KBDG中剂量组(0.45±0.08)、KBDG高剂量组(0.48±0.14)肺部病毒载量的相对表达量均明显降低(P＜0.01)。 (6)炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ的结果:IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ的基因表达:与空白组相比，模型组IL-6、IL-1β和IFN-γ升高(P＜0.01),TNF-α升高(P＜0.05)。与模型组相比，KBDG低剂量组IFN-γ降低(P＜0.05),IL-6、IL-1β和TNF-α也有所降低，但差异无统计学意义(P＞0.05);KBDG中剂量组IL-6降低(P＜0.05),IL-1β、TNF-α和IFN-γ降低(P＜0.01);KBDG高剂量组IL-1β降低(P＜0.05),IFN-γ降低(P＜0.01),IL-6和TNF-α下降无统计学意义(P＞0.05)。蛋白表达结果显示:与空白组相比，模型组IL-6、IL-1β、和TNF-α的蛋白表达水平增强(P＜0.05),IFN-γ表达增强(P＜0.01)。与模型组相比，KBDG低剂量组TNF-α和IFN-γ的蛋白表达下调(P＜0.05),IL-6和IL-1β的表达下调无统计学意义(P＞0.05);KBDG中剂量组IL-1β和TNF-α的蛋白表达下调(P＜0.05),IFN-γ表达下调(P＜0.01),IL-6的表达下调无统计学意义(P＞0.05);KBDG高剂量组IL-6的蛋白表达下调(P＜0.05),IFN-γ表达下调(P＜0.01),IL-1β和TNF-α的表达下调无统计学意义(P＞0.05)。 (7)Th17细胞及相关因子:Th17细胞的表达显示，与空白组相比，模型组小鼠Th17细胞百分比明显升高（P＜0.01）。与模型组比，KBDG低剂量组与中剂量组Th17细胞百分比下降（P＜0.01）;KBDG高剂量组Th17细胞百分比降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。RORγt和IL-17的基因表达显示，与空白组相比，模型组RORγt表达升高（P＜0.01）,IL-17表达升高（P＜0.05）。与模型组相比，KBDG低、中剂量组的RORγt基因表达水平降低（P＜0.01）,IL-17表达降低（P＜0.05）;KBDG高剂量组的RORγt和IL-17的表达均降低（P＜0.01）。RORγt和IL-17的蛋白表达显示，与空白组相比，模型组RORγt蛋白表达增强（P＜0.01）,IL-17表达增强（P＜0.05）。与模型组相比，KBDG低剂量组RORγt下调（P＜0.05）,IL-17表达下调无统计学意义（P＞0.05）;KBDG中剂量组RORγt和IL-17均下调（P＜0.01）;KBDG高剂量组RORγt下调（P＜0.01）,IL-17表达下调（P＜0.05）。 （8）Treg细胞及相关因子:Treg细胞的表达显示，与空白组相比，模型组小鼠Treg细胞百分比升高（P＞0.05）。与模型组比，KBDG高中低剂量组Treg细胞百分比降低（P＞0.05）。FOXP3、IL-10和TGF-β的基因表达显示，与空白组相比，模型组FOXP3的mRNA表达降低（P＜0.05）,IL-10和TGF-β的mRNA表达降低（P＜0.01)。与模型组相比，KBDG低剂量组IL-10、TGF-β显著升高（P＜0.01）,FOXP3升高无统计学意义（P＞0.05）;KBDG中、高剂量组FOXP3、IL-10和TGF-β均显著升高（P＜0.01）。FOXP3、IL-10和TGF-β的蛋白表达显示，与空白组相比，模型组FOXP3、IL-10蛋白表达水平下调（P＜0.05）,TGF-β的蛋白表达下调（P＜0.01）。与模型组相比，KBDG低剂量组FOXP3、IL-10表达上调（P＜0.05）,TGF-β表达上调（P＜0.01）;KBDG中、高剂量组FOXP3、TGF-β表达上调（P＜0.01）,IL-10表达上调（P＜0.05）。 （9）Th17/Treg细胞比值和IL-17/IL-10比值:与空白组相比，模型组小鼠Th17/Treg细胞比值和IL-17/IL-10比值升高（P＜0.05,P＜0.01）。与模型组比，KBDG低剂量组与中剂量组Th17/Treg细胞比值和IL-17/IL-10比值下降（P＜0.05）;KBDG高剂量组Th17/Treg细胞比值和IL-17/IL-10比值降低幅度无统计学差异（P＞0.05）。 研究结论 1.网络药理学研究初步揭示了KBDG治疗甲型流感的分子机制。KBDG的药物与甲型流感疾病之间，有IL-6、IL-1β、TNF、IFN-γ、TGF-β等多个共同作用靶点;这些共同靶点主要富集在IL-17、Th17细胞分化等免疫学通路上;这些信息相互作用,形成中药-活性成分-关键靶点-通路-疾病网络。 2.KBDG对IAV感染小鼠具有保护作用，可改善小鼠的一般状态，降低体重减轻幅度、肺指数和肺组织病毒载量，减少肺组织中IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ基因和蛋白表达，改善小鼠的肺部炎性病理损害程度。且细胞因子结果与网络药理学的研究结果一致。 3.KBDG具有免疫调节作用，其作用机制可能通过调节Th17细胞、Treg细胞及其相关免疫因子的分化和分泌，纠正Th17/Treg免疫失衡状态以治疗甲型流感。
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