摘要
油菜（BrassicanapusL.）是我国重要的油料作物，是国产食用植物油第一大油源，但我国植物油仍供不应求，严重依赖进口。长江中下游区域是我国油菜主产区，但主要采用的是水稻-油菜轮作模式，近年来为了保障水稻品质推迟了水稻的收获期，从而导致了油菜秋播的推迟，致使低温胁迫影响了油菜的萌发和幼苗生长，使其产量和品质降低。低温胁迫严重制约着我国油菜产业的发展，所以研究油菜耐低温萌发的遗传调控和分子机制具有非常重要的意义。在本研究中，我们挖掘和鉴定到了一种甘蓝型油菜耐低温萌发的新种质，将其命名为gec（Germinationundercold）。本研究在gec种质中检测了耐低温相关的生理生化指标；并用油菜耐低温萌发gec种质与不耐低温萌发材料Y127作为亲本杂交调查分离比，得出该性状为两对隐性基因控制；同时构建了后代分离群体采用集团分离分析法（BulkSegregantAnalysissequencing，BSA-seq）对gec负责耐低温萌发区域进行了初步定位；且通过转录组测序初步探索了耐低温萌发新种质gec可能的调控机制。主要研究结果如下： （1）本研究从323份油菜种质资源中鉴定到一种甘蓝型油菜耐低温萌发的新种质gec，其在4℃低温处理10天的萌发率为100%，而对照Y127的萌发率为0%。低温处理后，相比对照gec种质积累更少的活性氧（ROS）包括H2O2和O2ˉ，同时积累了更多的能清除O2ˉ的SOD酶和清除H2O2的POD酶。ROS过度的积累会损伤细胞组织，造成离子渗透。而低温胁迫后，种质gec细胞离子渗透更小。这与gec较低的活性氧含量和更高的抗氧化酶含量一致。另外gec种质中耐寒相关基因响应更迅速，种子中不饱和脂肪酸的含量也显著高于对照。这些都缓解了低温对gec种质的损害。 （2）甘蓝型油菜耐低温萌发种质gec和不耐低温萌发材料Y127正反交后F2代低温萌发与未萌发的性状分离比为1:15，表明了gec的耐低温萌发表型由两对隐性核基因控制。在F3代中筛选出低温萌发与未萌发性状分离比为1:3的株系以纯合其中一对隐性基因，用于后续BSA-seq和转录组分析。 （3）以F3代中低温萌发与未萌发性状分离比为1:3的株系进行BSA-seq，构建低温萌发（bulkH）和未萌发（bulkL）的样品混池，以及亲本gec与Y127混池。从BSA-seq结果看出，在C06染色体上出现了超过阈值水平的极显著峰，且这个显著关联区间在油菜基因组上的分布为Chr.C06：47.02—49.50Mb，长度为2.48Mb，该区段大效应变异有530个，覆盖基因114个，表明该区间可能具有引起油菜耐低温萌发的一个主效基因。 （4）将上述性状分离比为1:3的株系分为低温萌发组（H组）和未萌发组（L组）分别进行转录组测序，分析结果显示，共筛选到9156个差异表达基因，上调表达的基因有4691个，下调表达的基因有4465个。其中抗寒通路中的重要正调控转录因子DREB和MYB都被上调，说明了H组中启动了耐寒机制。在H组中BnaDREB1B和BnaDREB1C的上调提高了油菜的耐寒性，BnaMYB75和BnaMYBD的上调介导了花青素的合成，改善了低温对油菜造成的损害。另外，KEGG和GO富集分析表明，这些差异基因在质体途径、光合作用通路、非生物刺激的反应途径、苯丙烷途径、氧化还原酶活性途径和不饱和脂肪酸的生物合成等途径都有富集，H组很可能启动了这些途径以抵御低温胁迫。例如，氧化还原酶活性途径中LDOX等在H组中被低温显著诱导，该类基因上调可能会清除低温产生的ROS造成的伤害。不饱和脂肪酸通路中KAT5、ACX2、ECR、PED1、ACX3基因在H组中被低温胁迫后显著诱导，因此，油菜H组可能通过调整细胞膜中不饱和脂肪酸的含量维持细胞膜的流动性以抵御低温，这也是甘蓝型油菜耐低温萌发的一种重要的分子机制。负责苯丙烷合成途径中的关键基因PAL、C4H和4CL等也显著上调，促进了苯丙烷类物质的合成，缓解了低温胁迫对油菜种子萌发的影响。另外植物激素信号转导通路基因在H组中下调，其中负责ABA合成的DOG1和ABI5表达量下调，很可能是减少了ABA合成，从而打破了ABA对种子的休眠作用。相反，促进种子萌发的GA合成相关基因GA2ox1和GA3ox1在H组中上调。ABA和GA的这种拮抗作用，促进了油菜种子低温下的萌发。 （5）根据BSA-seq定位区间与转录组测序关联分析进一步确定候选基因，将BSA-seq定位区间内的114个大效应变异基因在转录组中差异分析，其中上调的基因有22个，下调的基因有11个。其中BnaC06T0371900ZS编码烯醇化酶，并参与光依赖的耐寒性，且该蛋白质酪氨酸可被磷酸化，其磷酸化状态会响应种子中的ABA含量而被调节，因此该基因很有可能是候选基因。接下来将设计分子标记验证连锁区间，根据标记筛选重组单株，进一步缩小区间，确定候选基因，并最终研究gec种质耐低温萌发的调控机制。
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