摘要
硒是维持人体生命活动的必需微量元素，参与机体多项重要生理功能，硒缺乏会导致机体产生众多不良症状，如机体免疫系统紊乱、增加心血管疾病风险、患有克山病等。中国有超过70%地区属于缺硒或贫硒区，因此市场上出现了硒补充剂，目前多以富硒酵母和亚硒酸钠为主，研究人员致力于开发新的补硒产品。乳酸菌硒属于一种新的有机硒形态，乳酸菌的活性与有机硒的双重优势使得乳酸菌硒作为新型硒补充剂具有巨大潜力，但目前大部分研究集中在乳酸菌富硒的能力，而乳酸菌硒的形态分布及功能优势尚未清楚。课题组前期筛选一株可高富集硒代半胱氨酸（SeCys）的乳酸菌——副干酪乳酪杆菌CCFM1089，其富硒培养后有机硒中SeCys占比高达89%。本研究通过动物实验评价了副干酪乳酪杆菌CCFM1089硒的生物学功能，并与两种成熟的硒补充剂进行比较；之后基于乳酸菌硒的形态及功能优势，筛选出更多高富集SeCys的乳酸菌；最后选择对机体补硒效果最佳的菌株进行富硒工艺优化，提高菌株富硒能力。主要研究内容如下： （1）以DSS诱导结肠炎作为评价乳酸菌硒生物学功能的模型，研究硒对小鼠免疫性炎症的影响。前期进行小鼠缺硒喂养，避免小鼠自身含有的硒引起实验误差。实验组灌胃活性CCFM1089硒与灭活CCFM1089硒，以副干酪乳酪杆菌CCFM1089、富硒酵母（富含硒代蛋氨酸）和亚硒酸钠作为对照组。结果显示，CCFM1089硒、富硒酵母和亚硒酸钠均能缓解小鼠的炎症症状，具体表现在结肠长度增长，促炎因子（IL-6、TNF-α和IL-1β）水平下降。并且与对照组相比，乳酸菌硒组的小鼠结肠组织粘膜更加完整，杯状细胞更富集，只有极少量炎性细胞浸润；此外乳酸菌硒可以显著提高硒酶（GSH-Px）活力，而且活性乳酸菌硒对DSS诱导结肠炎的缓解效果优于灭活乳酸菌硒。 （2）通过酒精性肝损伤（ALD）小鼠模型，研究乳酸菌硒在治疗肝脏相关疾病方面的功效。为深入研究乳酸菌硒的优势，评估低、中两种剂量对ALD的缓解效果，并与富硒酵母和亚硒酸钠比较。结果显示，乳酸菌硒能有效缓解小鼠ALD，即便是低剂量乳酸菌硒也能够显著缓解ALD，具体表现为乳酸菌硒干预后体重增长恢复，肝脏组织肿胀缓解，肝脏组织病理损伤及炎症程度降低，血清中AST和ALT的活性下降，回肠组织屏障功能恢复，机体抗氧化能力增强。乳酸菌硒提高硒酶活力的能力优于其他硒补充剂；活性乳酸菌硒提高硒酶活力的能力强于灭活乳酸菌硒。而且根据实验结果发现乳酸菌硒缓解ALD的作用机理可能是抑制keap-1的表达，上调Nrf2信号及下游靶点的表达，从而提高机体的抗氧化能力；乳酸菌硒也可以抑制TLR4介导的NF-κB的上调，降低体内促炎因子水平，达到缓解肝损伤的效果。 （3）两批实验结果都表明副干酪乳酪杆菌CCFM1089硒有较好的补硒效果，可以显著提高体内硒酶活性，缓解硒酶相关的疾病症状，也间接说明SeCys具有更好的益生效果，而且乳酸菌的活性也促使SeCys在体内发挥了更好的功效，因此新筛选出三株能够高富集SeCys的乳酸菌，分别是罗伊氏粘液乳杆菌CCFM1303（总硒含量为530.7mg/kg，有机硒中SeCys占98.4%）、嗜酸乳杆菌CCFM1304（总硒含量为453.1mg/kg，有机硒中SeCys占95.3%）、格氏乳杆菌CCFM1305（硒含量为557.9mg/kg，有机硒中SeCys占93.5%）。 （4）通过缺硒小鼠实验，比较副干酪乳酪杆菌CCFM1089硒与新筛选的乳酸菌硒对机体的补硒功效，选出效果最佳的乳酸菌硒——罗伊氏粘液乳杆菌CCFM1303硒。并从氨基酸、氮源、盐胁迫、pH、加硒时间等方面对罗伊氏粘液乳杆菌CCFM1303进行富硒工艺优化，以提高其生物量和高富硒能力。结果显示，当培养基成分为：葡萄糖20g/L、酵母浸粉FM80320g/L、无水乙酸钠2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2HPO42g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、MnSO4·H2O0.05g/L、Na2SeO36.57mg/L、吐温801mL/L、丝氨酸0.35g/L、NaCl30g/L，并且培养条件pH为5.5，其中Na2SeO3溶液单独配置，在种子液接入培养基生长6h后加入硒溶液时，罗伊氏粘液乳杆菌CCFM1303的富硒能力高达849.6mg/kg，OD600为2.1。
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