摘要
目的：当今社会，随着国民生活水平的逐步提升及生活节奏的不断加快，饮食性肥胖及其引起的各种代谢性疾病，如胰岛素抵抗(Iusulinresistance,IR)等已经成为威胁人类健康的主要因素。临床研究发现，西药(曲格列酮、吡格列酮、罗格列酮等二酮类化合物)在改善IR同时，对机体和肝脏均具有一定程度的毒副作用。因此，寻找副作用小、安全有效的新型抗IR药物具有重要意义。脂肪组织作为体内胰岛素作用的关键靶点，以及糖脂代谢发生的主要场所，其与IR之间的内在调控机制已成为国内外学者近几年的研究热点。青钱柳为胡桃科青钱柳属植物，因其降糖、降脂等功效而备受研究者青睐。课题组前期研究发现：青钱柳叶中以碟卡苷B为代表成分的三萜苷提取物，即青钱柳甜苷(SweettriterpenoidglycosidefromtheleavesofCyclocaryapaliurus,CPST)对链脲霉素损伤的大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)细胞具有较好的保护作用；可显著降低HepG2细胞内甘油三酯(Triglyceride,TG)、总胆固醇(Totalcholesterol,TC)含量，抑制HepG2细胞内的脂质积累，显示其具有良好的降脂活性，提示CPST有调控脂肪组织内糖脂代谢的潜能，这为研究CPST改善脂肪组织IR提供了新思路，同时为开发新型防治IR药物提供了新方向。 方法：(1)体外实验部分：选用与白色脂肪细胞功能及特性相近的3T3-L1细胞，采用诱导剂：3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine,IBMX)、地塞米松(Dexamethasone,DEX)和胰岛素(Insulin,INS)对其进行经典IR造模处理，后续给予CPST，观察细胞分化情况，并采用MTT法检测细胞活力、油红O染色法检测脂滴数量及脂质积累，同时对TG含量、TC含量及其α-糖苷酶抑制率进行检测，Gresis法测定细胞上清液中一氧化氮(Nitricoxide,NO)含量；采用透射电镜观察细胞炎性情况及细胞整体结构、亚细胞结构，利用荧光探针观察核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、细胞凋亡中含CARD的相关斑点样蛋白(ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)在亚细胞水平是否存在共定位，利用Westernblot法测定细胞中Toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)/NLRP3通路中TLR4、髓细胞分化初级反应基因88(MyelocytedifferentiationprimaryresponseGene88,MyD88)、NF-кB、p-NF-кB、NLRP3、ASC、半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)、白介素(Interleukin,IL)-18、IL-1β、硫氧还蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin-interactingprotein,TXNIP)和Gasdermin-D(GSDMD)蛋白表达。 (2)体内实验部分：选用C57BL/6J小鼠，进行高脂饮食(Highfatdiet,HFD)喂养，后续给予不同剂量CPST(CPST-25mg/kg、CPST-50mg/kg、CPST-100mg/kg)药物治疗处理8个月，观察其饮食及体质量变化情况，期间测定其IR指数，取材后进行伊红-苏木素(Hematoxylin-eosin,HE)染色并进行横截面积计算及各脂肪指数测定，利用Westernblot法测定白色脂肪(Whiteadiposetissue,WAT)及肩胛间棕色脂肪(Interscapularbrownadiposetissue,iBAT)中TLR4/NF-κB/NLRP3通路中TLR4、MyD88、NF-кB、p-NF-кB、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-18、IL-1β、TXNIP和GSDMD蛋白表达。 结果：(1)体外实验：MTT检测发现，CPST(1.5625-200μg/mL)培养1、3、5和7天后，细胞活力较同时间点的Control组明显降低，与同时间点的Model组比较具有显著性差异(Plt;0.01)，而在浓度为1.5625-25μg/mL的CPST对细胞没有表现出任何毒性；油红O染色发现Model组较Control组有明显脂滴产生，表明IR模型建立成功；用CPST(1.5625-25μg/mL)分别处理3、5、7天后，各给药组脂滴数量较Model组明显减少，以CPST(3.125-12.5μg/mL)作用7天时的作用效果最佳；细胞内脂质积累情况、TG和TC含量检测进一步证实CPST(3.125-12.5μg/mL)作用7天时显著抑制3T3-L1细胞中脂质积累，降低细胞中TC、TG含量，与Model组比较具有显著性差异(Plt;0.05或Plt;0.01)。α-葡萄糖苷酶活性检测表明，与阳性药阿卡波糖(0.03mol/L)相比，CPST(3.125-12.5μg/mL)降糖效果较优(Plt;0.01)；上清液中NO含量分析表明Control组NO含量显著高于Model组(Plt;0.01)。结合MTT实验结果可知，Control组在未使用诱导剂进行自我分化时存在损伤，当用CPST处理3T3-L1细胞1、3、5或7天后，在3.125-12.5μg/mL浓度下，NO含量显著降低(Plt;0.05或Plt;0.01)，提示在该浓度范围内，CPST减轻了3T3-L1细胞分化过程中的炎症损伤。透射电镜观察显示，Control组脂肪细胞线粒体活跃，形态正常，结构完整，呈长梭形，线粒体嵴清晰整齐，细胞膜完整清晰；Model组细胞核体积及细胞显著增大，并呈现溶胀现象，胞内脂滴明显分泌，线粒体形态损毁，损伤严重；用CPST(6.25、12.5、25μg/mL)处理后，受损细胞整体结构、亚细胞结构均得到明显改善，且呈现出了一定的剂量依赖性。根据免疫荧光图谱结果可知，Control组细胞内NLRP3、ASC、caspase-1均呈现低表达状态，且三者间共定位重合部分少，荧光吸收强度不一，其中ASC与caspase-1间呈现相对较高的荧光重合率，NLRP3与两者相较荧光强度较弱。Model组中上述三种荧光强度显著上升，且重合度极高，荧光吸收强度情况相似，在给予CPST(6.25、12.5、25μg/mL)药物处理后，各荧光强度均有所减弱，但仍存在共定位情况，较Model组有显著改善。Westernblot结果表明，Model组TLR4、MyD88、p-NF-кB/NF-кB、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-18、IL-1β、TXNIP和GSDMD蛋白及GLUT4蛋白的表达水平较Control组显著升高(Plt;0.01)，pro-IL-1β及IRS-1蛋白表达水平显著降低(Plt;0.01)，用CPST(3.125、6.25、12.5、25μg/mL)处理后，上述情况均得到明显逆转，与Model组比较具有显著差异(Plt;0.01)。 (2)体内实验：对小鼠体质量的监测结果显示，Model组小鼠的体重显著高于Control组(Plt;0.05或Plt;0.01)，且其生长速度明显高于Control组(Plt;0.01)。给予CPST治疗后，体重增长率明显降低，且存在明显的量效关系(Plt;0.05或Plt;0.01)。小鼠血清生化分析结果显示，Model组血液中GLUO、LDL-C、TG、TC含量明显升高，HDL-C明显降低，与Control组比较具有显著性差异(Plt;0.01)；用CPST治疗后，上述指标的异常变化得到显著逆转(Plt;0.05或Plt;0.01)。葡萄糖耐受试验和胰岛素耐受试验表明，Model组IR指数显著高于Control组(Plt;0.01)；CPST治疗后IR指数显著降低(Plt;0.05或Plt;0.01)。HE染色结果显示，Control组脂肪细胞排列紧密，细胞大小及形态较均一，呈多边形或圆形，而Model组脂肪细胞大小明显增加，形态不规则，成大空泡状，细胞膜边缘变薄，细胞间隙明显变宽，且出现花冠样结构，出现炎性细胞浸润；肩胛间棕色脂肪和皮下、腹股沟、附睾白色脂肪组织横截面积均明显大于Control组，棕色脂肪含量显著降低，白色脂肪含量明显升高(Plt;0.01)；用CPST治疗后，上述异常形态均得到明显改善，肩胛间棕色脂肪、皮下脂肪、腹股沟脂肪、附睾脂肪组织横截面积明显降低，棕色脂肪含量显著增加，白色脂肪含量减少，且呈现一定的剂量依赖性(Plt;0.05或Plt;0.01)。Model组组织中TLR4、MyD88、p-NF-кB/NF-кB、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-18、IL-1β、TXNIP和GSDMD蛋白表达水平较Control组显著升高(Plt;0.01)，用CPST(25、50、100mg/mL)治疗后，TLR4、MyD88、p-NF-кB/NF-кB、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-18、IL-1β、TXNIP和GSDMD蛋白表达明显降低，与Model组比较具有显著性差异(Plt;0.05或Plt;0.01)。 结论：CPST对HFD诱导的IR具有改善作用，证实其作用机制与抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路激活，减轻脂肪细胞炎症反应，改善葡萄糖和胰岛素耐量，增强脂肪细胞对胰岛素的敏感性，抑制IL-18、IL-1β、TC、TG生成和脂质积累，促进WAT褐变为iBAT，抑制iBAT白化为WAT有关。以上结果显示了CPST在IR防治上良好的应用前景。
NETL