摘要
染料脱色过氧化物酶（Dye-decolorizingPeroxidases,DyPs）是近年来新发现的一类以血红素为辅基的过氧化物酶，可用于木质素与多种染料的降解。目前已在大肠杆菌等工程菌中实现了DyPs的异源表达，但由于辅因子血红素的缺乏导致酶活性低。因此，在对DyP酶进行高效表达的同时，提升辅因子血红素产量至关重要。本研究以大肠杆菌（Escherichiacoli）BL21(DE3)为出发菌株，通过对血红素合成途径的改造、减少前体物质的外泌与调控血红素合成途径基因的表达等策略获取了高产血红素菌株；将经过改造得到的血红素高产菌株作为宿主菌表达DyP酶，大幅提升了TfuDyP的酶活力。主要研究内容和结果如下： （1）E.coli血红素C5途径的强化。血红素合成关键前体5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinicacid,ALA）通过C4或C5两条途径合成，E.coli以C5途径合成ALA，首先以可积累前体卟啉的tolC缺失菌株WTΔT为出发菌株，过表达C5途径中编码谷氨酰-tRNA还原酶的hemA基因，用于提高细胞内ALA的水平，从而增加卟啉的积累；随后共同过表达编码亚铁螯合酶的hemH基因，将积累的卟啉转化为血红素，血红素产量提升至34.69μmol·L-1，为野生菌的3.44倍；通过外源添加亚铁离子进一步提升血红素的产量，最终在添加80μmol·L-1的亚铁离子时获得了40.18μmol·L-1的血红素产量，达到了野生菌的3.98倍。 （2）E.coli血红素C4途径的构建。通过Red同源重组的方法敲除了C5途径中编码谷氨酸-1-半醛-2,1-变位酶的hemL基因，得到了C5途径缺失菌株WTΔL，进而异源表达来自类球红细菌（Rhodobactersphaeroides）的ALA合酶（RspHemA,hemAR），得到了以C4途径合成血红素的菌株WTΔL/pCAR；WTΔL/pCAR的血红素产量达到43.51μmol·L-1，远高于野生菌、C5途径过表达菌株与两途径共表达菌株的血红素产量；随后过表达了血红素合成途径下游的hemH基因与编码ALA脱水酶的hemB基因，进一步提升了血红素产量至59.46μmol·L-1，为野生菌的5.89倍。 （3）血红素过氧化物酶的异源表达及酶活分析。将本实验室保存的来自嗜热放线菌（Thermobifidafusca）的TfuDyP导入本研究所获得的血红素高产菌株，并检测酶活力。结果显示含有中拷贝质粒pET28a表达TfuDyP基因与低拷贝质粒pCDFDuet1表达hemAR的工程菌WTΔL/pCAR-pED与WTΔT/pCAR-pED的酶活分别为30.25U·mg-1与32.75U·mg-1，是野生菌中单独表达TfuDyP的WT/pED菌株的5.98与6.47倍；对TfuDyP进行蛋白纯化，重组菌WTΔT/pCAR-pED表达的酶活力进一步提升至110.63U·mg-1。 以上结果表明，血红素代谢途径的调控可以提高以血红素为辅基的重组TfuDyP。
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