摘要
研究背景及目的 炎症性肠病(Inflammatoryboweldisease,IBD)是以消化道溃疡为主要病理表现的自身免疫性疾病，炎损组织迁延难愈、患者症状渐进加重。其中，患者改善症状的急迫需求和阻碍炎-癌转化的关键靶点在于诱导病损处肠黏膜深度、有效修复。但遗憾的是，临床IBD治疗仍过度倚重于“抗炎止损”的策略，仅能有效保护既有肠黏膜组织、短期快速阻断进展，但如何加强病灶肠黏膜修复新生仍旧是IBD治疗的难点和热点，成为满足IBD临床需求，克服IBD治疗瓶颈的必由之路。 肠黏膜的修复主要依赖于肠道干细胞(Intestinalstemcells,ISC)的快速增殖、有效分化、功能成熟。IBD免疫微环境表型的动态变迁与上述三个过程紧密偶联。在IBD的免疫微环境中，巨噬细胞是肠道免疫稳态的看门人，其通过M1/M2的免疫表型极化改变了炎症“促进-消散”的平衡，并进一步对于ISC介导的修复过程起到了决定性作用，成为实现肠黏膜修复的重要落脚点。前期研究表明，双氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)在多种自身免疫疾病中具备明确有效性。在此基础上，在三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitro-benzenesulfonicacid,TNBS)、恶唑酮(Oxazolone,OXA)等诱导的多种IBD动物模型中，DHA抗炎活性明确且能够诱导巨噬细胞表型极化转变，阻断结肠炎-癌转化。此外，DHA的体内药代动力学研究表明，其无论口服还是注射给药均主要分布于胃肠道，为其聚焦于胃肠道的抗炎活性研究提供了组织分布特征的合理性支撑。 综上所述，DHA是研究基于“免疫稳态-修损平衡”偶联理论促进肠黏膜愈合的优良候选药物。但DHA前期研究仍存在如下不足:(1)活性认识局限:在自身免疫病研究中局限于其直接、单纯抗炎的活性评价;(2)药物机理不明:在IBD中，DHA诱导巨噬细胞M2极化的深层次系统性效应描述、潜在药物作用靶点和分子机制研究仍为空白;(3)应用潜质尚待挖掘:DHA调节免疫稳态后产生的促进黏膜修复效应及两者的因果依赖关系亟待揭示。 前沿研究表明:免疫细胞的代谢模式重塑一方面决定了免疫表型的极化状态,另一方面也对其功能的输出产生关键影响。巨噬细胞代谢的整体性变动是其免疫表型转变的底层逻辑。具体而言:M1型巨噬细胞以有氧糖酵解为主要供能途径。其三羧酸循环阻断，柠檬酸、琥珀酸等代谢产物积累，这种代谢模式有利于快速产生三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate,ATP)和积累大量免疫损伤介质，维系促炎免疫表型功能。相比之下，M2型巨噬细胞以氧化磷酸化为主要供能模式，保有完整的三羧酸循环兼备高水平谷氨酰胺和脂肪酸氧化供能，这种代谢模式能有效降低促炎水平、加强主动消散，重塑炎症平衡，并高效的为组织修复提供充足的能量供给和产物支持。 综上所述，我们提出如下假说:IBD模型中，DHA能够基于诱导巨噬细胞M2免疫代谢的机制，诱导病灶形成促修复的免疫微环境，促进ISC的增殖分化、功能成熟，最终实现肠上皮修复，改善肠道功能。本课题的有效完成，将从以下几个方面有助于未来IBD临床和药物研发的完善和补充:(1)立足于免疫微环境调控的平衡特征，拓展了DHA既往单纯抗炎的活性认识。(2)论证了DHA在肠黏膜修复治疗中的潜在价值。(3)深度解析DHA双向重塑炎症反应“促-消”平衡，加强黏膜修复的分子靶点和机制通路。(4)依据“代谢-免疫-修复”链条，搭建相关研究方法和技术体系，为IBD黏膜愈合治疗的中药研发提供技术支持。 研究方法与内容 1评价IBD模型小鼠肠黏膜修复及功能重建的DHA特异性药效研究 本部分研究从疾病评分、肠道组织愈合、肠道功能重建角度全方面、立体性评价DHA促进损伤肠道修复的药效，支持DHA促进肠黏膜深层愈合的假说。 (1)构建侧重黏膜修复的DSS特异性损伤模型以及疾病评分 本部分使用3％葡聚糖硫酸钠(Dextransodiumsulfate,DSS)诱导小鼠肠道损伤作为IBD研究模型，用梯度剂量DHA(2.5mg/kg/day、5mg/kg/day、10mg/kg/day)和临床一线用药泼尼松龙(Prednisolone,PLN)(5mg/kg/day)进行干预，并设计了2种给药方案:①全程给药方案:除NC组小鼠外，其余各组小鼠按体重分组后，在3％DSS损伤期、自主修复期和1.5％DSS复发期均进行给药，以探究DHA在哪个疾病阶段药效最佳;②仅在修复期给药方案:NC组小鼠外，其余各组小鼠根据损伤期末期DAI疾病评分分组后，仅在自主修复期给药。两种模型小鼠均以每日DAI疾病评分作为评价疾病严重程度的指标。 (2)DHA加快小鼠修复期肠黏膜愈合的组织学水平评价 取仅在修复期给药的各组小鼠在修复中期和修复末期的结肠和粪便进行检测;通过检测各组小鼠粪便中钙卫蛋白(Calprotectin,CALP)含量以指示其肠黏膜深层炎症水平和复发风险;根据各组小鼠的结肠长短、结肠组织苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosinstaining,HE染色)中观察到的炎性浸润情况和隐窝完整性情况评价其损伤结肠在组织学愈合水平。 (3)DHA促进小鼠肠道功能恢复评价 采用仅在修复期给药的各组小鼠，通过复发末期小鼠肠道异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanateisomer,FITC)渗透性实验评价小鼠肠道屏障功能的修复水平;通过修复中期小鼠结肠阿利新兰染色的酸性分泌液着色面积评价小鼠结肠分泌功能的恢复情况;通过修复期不同阶段各组小鼠1小时(hour,h)粪便排出颗粒数和粪便含水量评价小鼠结肠运动和重吸收功能的恢复情况。 2.基于巨噬细胞代谢重塑探索DHA促进肠黏膜修复的药理研究 本部分研究首先通过腹腔巨噬细胞移植模型、“巨噬细胞-ISC”共培养单元等平台，明确巨噬细胞在DHA介导肠黏膜修复过程中的必要地位，回答“DHA能否基于巨噬细胞促进肠黏膜愈合？”这一问题。之后，使用小鼠肠道巨噬细胞转录组测序，全基因、无偏倚地考察DHA诱导巨噬细胞表型和代谢改变，并对具体途径进行具体分析，回答“DHA重点调控了巨噬细胞何种功能？”这一问题。 (1)明确在小鼠体内巨噬细胞是DHA的有效靶细胞 采用仅修复期给药模型，通过回输移植经DHA处理有诱导的腹腔巨噬细胞作为修复期给药途径，明确经DHA诱导后的巨噬细胞具有促进损伤结肠修复的功能。 采用DHA直接干预IEC-6上皮细胞或肠道类器官，与经DHA诱导的巨噬细胞培养基干预IEC-6细胞或肠道类器官，比较两种情况下上皮细胞的增殖能力、类器官的生长和出芽能力，以明确巨噬细胞在DHA介导的肠黏膜再生过程中的重要地位。 使用正常和经DHA诱导的RAW264.7细胞与荧光类器官共培养，采用类器官移植的方法将与不同巨噬细胞共培养的荧光类器官移植回结肠损伤小鼠体内，观察类器官在损伤部位的定植和生长面积，以反映DHA诱导的巨噬细胞对ISC再生成肠道上皮的功能影响。 (2)DHA诱导巨噬细胞极化表型转变检测 提取仅修复期给药模型中，M和DHA-H组小鼠修复中期的肠道固有层巨噬细胞，进行转录组测序，从网络整体变动的角度分析DHA干预后小鼠肠道巨噬细胞极化表型的转变。采用RAW264.7巨噬细胞，给予脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)(100ng/mL)和干扰素γ(Interferonγ,IFN-γ)(20ng/mL)造模、各剂量DHA(0.5μM、1μM、2μM)和PLN(25μg/mL)给药，使用Westernblot检测各组细胞内M2极化修复标志物精氨酸酶1(Arginase1,Arg-1)和抵抗素样分子α(Resistin-likeα,RELMα)的表达以判断其M2极化转变。 (3)DHA诱导巨噬细胞代谢模式转变检测 提取DSS仅修复期给药模型中，M和DHA-H组小鼠修复中期的肠道固有层巨噬细胞，进行转录组测序，系统分析DHA重塑免疫代谢的转录组网络。采用RAW264.7巨噬细胞，给予LPS(100ng/mL)和IFN-γ(20ng/mL)造模，和DHA(2μM)给药，使用SeahorseXF能量代谢分析仪测量RAW264.7在DHA干预后细胞ATP生成的代谢模式转变，分析DHA对细胞能量代谢的影响情况;采用RAW264.7巨噬细胞，给予LPS(100ng/mL)和IFN-γ(20ng/mL)造模、各剂量DHA(0.5μM、1μM、2μM)和PLN(25μg/mL)给药，使用乳酸含量试剂盒检测各组细胞内产生的乳酸水平;观察各给药组细胞在饥饿状态下对葡萄糖类似物2-NBDG的吞噬量，并用RT-qPCR检测各组细胞中葡萄糖转运蛋白-1(Glucosetransporter-1,Glut-1)的mRNA相对含量以评价各组细胞对葡萄糖的需求和利用水平。 3.基于“代谢-免疫-修复”的DHA分子靶点研究 本部分研究首先对DHA在巨噬细胞中的靶点进行筛选和对接验证，之后在DHA调控免疫代谢重塑的关键靶点分子缺失的条件下，完成DHA“巨噬细胞-ISC”共培养单元中的药效评价及差异分析，回答“DHA调控免疫代谢重塑与肠黏膜愈合的依赖关系为何？”这一问题。 (1)DHA药物靶点的预测筛选和虚拟对接 采用DassaultSystemesBIOVIATMDiscoveryStudio2020(DS)软件在CentOS7环境下计算，实现DHA作用靶点的虚拟筛选，并对所得靶点分子之间的相互关联进行分析，以聚焦其中核心分子;并对所筛选到的分子与DHA结合的相互作用模式、空间结构特征、关键结合位点和结合能进行预测。 (2)DHA靶点结合验证 采用分子模拟技术模拟DHA与筛选到的分子11β羟基类固醇脱氢酶1(11-beta-dehydrogenaseisozyme1,11βHSD-1)所形成的复合物进行100ns分子动力学模拟，通过绘制均方根偏差(rootmeansquareerror,RMSD)和均方根波动(rootmeansquaredeviation,RMSF)分析和确认复合物的稳定性;采用药物亲和反应的靶点稳定性(drugaffinityresponsivetargetstability,DARTS)技术，在RAW264.7细胞中验证DHA与分子11βHSD-1结合情况。 (3)DHA靶点功能验证 ①DHA基于11βHSD-1诱导巨噬细胞免疫代谢重塑:使用11βHSD-1抑制剂(BVT14225)抑制RAW264.7细胞内11βHSD-1活性后，再给予LPS(100ng/mL)和IFN-γ(20ng/mL)造模、各剂量DHA(0.5μM、1μM、2μM)和PLN(25μg/mL)给药，检测各组巨噬细胞Arg-1等M2极化标志蛋白表达水平、糖酵解和氧化磷酸化分别生成ATP水平、细胞内乳酸含量、Glut-1的mRNA相对含量和饥饿时吞噬2-NBDG水平，以确定DHA能够通过激活11βHSD-1实现调控巨噬细胞向M2极化和代谢转变。 ②DHA基于11βHSD-1诱导巨噬细胞促进ISC增殖分化:采用正常和经DHA诱导的RAW264.7细胞，构建“巨噬细胞-类器官”共培养体系，用免疫荧光的方法检测与其共培养的类器官中增殖指标G蛋白偶联受体5(LeucinerichrepeatcontainingGprotein-coupledreceptor5,Lgr5)、增殖标志蛋白Ki-67(ProliferationmarkerproteinKi-67,Ki67)和分化指标粘蛋白2(Mucin2,Muc2)的表达情况,以反映巨噬细胞是否促进ISC增殖分化;使用BVT14225抑制RAW264.7细胞内11βHSD-1活性后，再考察与其过继培养后肠道类器官增殖分化状态，以确定DHA基于激活巨噬细胞11βHSD-1实现促进ISC增殖分化功能。 4.DHA调控巨噬细胞“代谢-免疫-修复”偶联机制探索 本部分研究基于前期筛选和文献查询，对DHA调控巨噬细胞“代谢-免疫-修复”偶联机制进行初步探索，并在关键分子靶点缺失的情况下进行验证，回答“DHA调控“代谢-免疫-修复”偶联机制为何？”这一问题。 采用RAW264.7巨噬细胞，给予LPS(100ng/mL)和IFN-γ(20ng/mL)造模、各剂量DHA（0.5μM、1μM、2μM）和PLN（25μg/mL）给药，用RT-qPCR检测各组细胞中景天庚酮糖激酶（Sedumheptanoneglucokinase,CARKL）的mRNA相对含量;使用Westernblot检测各组细胞信号转导及转录激活蛋白6（Signaltransducerandactivatoroftranscription6,STAT6）、磷酸化-STAT6（Phospho-STAT6,p-STAT6）、信号转导及转录激活蛋白3（Signaltransducerandactivatoroftranscription3,STAT3）、p-STAT3等相关蛋白的表达情况;使用BVT14225抑制RAW264.7细胞内11βHSD-1活性后，再给予细胞与上述一致的造模和给药，使用RT-qPCR和Westernblot检测各组细胞CARKL的mRNA相对含量以及STAT6、p-STAT6、STAT3、p-STAT3等相关蛋白的表达情况。提取DSS仅修复期给药模型中，M和DHA-H组小鼠修复中期的肠道固有层巨噬细胞，进行转录组测序，分析其Wnt通路配体等与修复相关细胞通路的转录水平。 研究结果 1.DHA能够在肠黏膜修复的特异性模型中具备加速小鼠肠黏膜愈合，改善病损结肠功能的药效 （1）DHA能够在疾病整体评分和组织病理学水平加快小鼠修复期肠黏膜愈合 全程给药的DAI评分表明DHA各给药组主要在模型的修复期发挥促进肠黏膜愈合、加快肠道屏障重建的药效。同样，在修复期给药模型中，DHA各给药组依然能够加快修复期疾病评分降低，抑制复发期DAI评分上升。从结肠组织结构的修复水平看，在修复中期（Day10）能够明显看出DHA各给药组小鼠结肠黏膜内炎性浸润程度明显减轻，隐窝数量高，结构完整，并且结肠长度恢复加快。修复中期（Day10）DHA各给药组小鼠粪便内CALP水平下降，指示其深层黏膜损伤缓解。在修复末期（Day14）各组小鼠结肠长度均恢复至基本一致，但模型组小鼠结肠黏膜仍有炎性浸润，隐窝数量少、结构异常。而DHA各给药组小鼠黏膜组织基本恢复正常。上述结果表明，DHA各剂量能够从结构组织水平促进小鼠损伤后肠黏膜恢复。 （2）DHA能够促进小鼠受损肠道的功能恢复 我们检测了小鼠结肠屏障功能（FITC渗漏）、修复期结肠的黏膜分泌蛋白水平（阿利新兰染色）、结肠对水分的吸收水平（小鼠粪便含水量）和结肠运动能力（小鼠1h粪便排出个数），结果均表明DHA各剂量能够促进小鼠损伤结肠功能的恢复。除此之外，上述结果DHA各给药组与糖皮质激素组相比均具有显著优势,表明DHA不同于糖皮质激素的单一抗炎活性，反而在促进黏膜愈合，加快疾病缓解方面具有显著优势。 2.DHA能够靶向巨噬细胞，加强巨噬细胞氧化磷酸化，诱导其向M2型代谢重塑 (1)巨噬细胞是DHA促黏膜修复的必要落脚点 腹腔巨噬细胞回打移植实验表明DHA诱导的巨噬细胞在体内具有促进肠黏膜愈合的药效。基于THP-1/IEC-6共培养和“巨噬细胞-类器官”培养单元，实验表明DHA促进ISC增殖、分化和功能成熟依赖对巨噬细胞的诱导。 (2)DHA促进巨噬细胞向M2表型极化转变 从巨噬细胞极化表型角度，小鼠肠道巨噬细胞测序结果进行GSEA分析表明,相较于DSS模型组，DHA给药组肠道巨噬细胞普遍向M2表型极化。使用RAW264.7细胞在体外也检测出相较于模型组，DHA各给药组细胞内促进胞葬、外基质释放等M2极化分子表达上调。 (3)DHA加强巨噬细胞氧化磷酸化，使其实现免疫代谢重编程 小鼠肠道巨噬细胞测序结果经GO和KEGG富集分析表明，相较于DSS组，DHA对于巨噬细胞的代谢影响显著，尤其是对糖和能量代谢的影响明显:DHA具有抑制巨噬细胞糖酵解，上调细胞内氧化磷酸化的趋势，促进ATP合成和转运。我们使用Seahorse细胞能量代谢仪检测结果显示，相较于模型组，DHA能够显著诱导巨噬细胞通过糖酵解产能降低，氧化磷酸化产能增高。此外，经DHA诱导后,RAW264.7细胞对葡萄糖摄取减少，细胞内乳酸含量降低。 3.巨噬细胞内11βHSD-1是DHA发挥药效的分子靶点 (1)DHA药效靶点筛选以及分子对接验证 使用DassaultSystemesBIOVIATMDiscoveryStudio2020(DS)软件进行DHA的靶点筛选，并将所得结果使用String数据库预测所得分子间的相互联系，聚焦其中核心分子为11βHSD-1。使用AutoDock-Vina1.1.2软件模拟11βHSD-1与DHA的分子对接，结果显示DHA与11βHSD-1的相对结合能为-8.6kcal/mol,表明两者极易形成复合物。且根据对接打分及分析，DHA和11βHSD-1间存在Pi-Sigma键、Pi-Alkyl键、Alkyl键、范德华力等。 分子动力学模拟结果显示RMSD曲线平稳震动，表明11βHSD-1分子与DHA形成的复合物能够以稳定状态存在;RMSF曲线可观察到特定区域有较高柔性,表明形成的复合物原子具有一定自由度，能够行使一定功能。DARTS实验表明DHA能够与RAW264.7细胞中11βHSD-1分子结合，保护11βHSD-1分子不被链酶降解。 (2)DHA能够依赖激活11βHSD-1,诱导巨噬细胞代谢重塑促进ISC再生 在巨噬细胞免疫代谢重塑方面，抑制巨噬细胞中11βHSD-1激活后，DHA不再具有诱导巨噬细胞上调Arg-1、RELMα等M2修复标志物表达，降低巨噬细胞糖酵解水平、降低巨噬细胞葡萄糖摄取和细胞内乳酸含量，促进氧化磷酸化水平。在促进ISC再生方面，抑制巨噬细胞中11βHSD-1激活后，DHA不再具有促进类器官增殖分化的药效，表明DHA依赖11βHSD-1调控免疫代谢重塑与肠黏膜愈合。 4.11βHSD-1/CARKL/STATs/Wnts是DHA介导“代谢-免疫-修复”关键信号通路 DHA能够显著诱导巨噬细胞内CARKL转录上调，促进下游STAT3/STAT6磷酸化，转录Wnt家族多种促修复配体，且上述药效在巨噬细胞内11βHSD-1阻断后消失。结合全文研究结果，证明DHA可以通过11βHSD-1/CARKL/STATs/Wnts信号通路实现巨噬细胞代谢重塑、免疫表型极化、并最终启动修复。 结论 综上所述，我们得到以下结论: (1)DHA能够促进肠道黏膜有效愈合，具有改善肠道功能的药效; (2)巨噬细胞是DHA促进ISC增殖分化，维系肠黏膜完整性的靶细胞; (3)DHA降低巨噬细胞糖酵解水平，增强巨噬细胞氧化磷酸化，诱导巨噬细胞向M2修复表型极化; (4)11βHSD-1是DHA调控免疫代谢重塑，实现肠黏膜愈合的分子靶点。11βHSD-1/CARKL/STATs/Wnts是DHA介导“代谢-免疫-修复”关键信号通路。
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