摘要
2′-岩藻糖基乳糖（2′-Fucosyllactose,2′-FL）是母乳寡糖（Humanmilkoligosaccharides,HMOs）中含量最高的功能成分之一，对婴幼儿的健康发育和成长具有极其重要的生理功能。由于它具有促进肠道益生菌生长、保护婴幼儿肠道健康和提高免疫功能的生理功能，因此具有很高的研究价值。目前，2′-FL已被美国FDA批准，可作为新资源食品配料添加到食品中，具有广阔的应用前景。2′-FL主要通过化学法、酶法和生物合成法合成。然而，传统的化学合成方法存在一些问题，如使用有毒试剂，步骤繁琐，合成效率低等。酶法合成通常需要使用昂贵的岩藻糖基供体作为原料，成本高。生物合成法可以使用工业微生物如大肠杆菌和酿酒酵母作为宿主，使用低成本的的碳源作为发酵底物，具有条件温和、成本低、环境友好等优点，已成为当今研究热点。本研究利用代谢工程策略，以大肠杆菌BL21(DE3)作为出发菌株，通过从头合成途径，设计了一条高效的生物合成2′-FL的路线。主要研究结果如下： （1）从头合成途径的构建：克隆来自于E.coliBL21(DE3)中编码磷酸甘露糖酶的基因manB，编码甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶的基因manC，编码GDP-甘露糖脱水酶的基因gmd、编码GDP-L-岩藻糖合成酶的基因wcaG，得到重组质粒pRSF-CBGW，从而实现在宿主中过表达GDP-L-岩藻糖从头合成途径的四个关键酶。接着克隆来自于E.coliO126中编码α1,2-岩藻糖基转移酶的基因wbgL，得到重组质粒pET-W，实现微生物从头合成2′-FL的途径构建。将上述两质粒共同转入大肠杆菌衍生菌BWL中，得到重组工程菌BWL-W，并通过摇瓶发酵，2′-FL产量达到3.27g/L，乳糖转化率为0.74mol2′-FL/mol。 （2）调控GDP-L-岩藻糖的表达水平：RcsA和RcsB是大肠杆菌中荚膜异多糖酸合成途径的正向转录调控因子。因此过表达rcsA和rcsB基因可用于上调控制GDP-L-岩藻糖合成酶ManB、ManC、Gmd、WcaG的表达，从而促进GDP-L-岩藻糖在胞内的积累。通过重组质粒pET-ABW引入正转录调控因子RcsA、RcsB，得到重组工程菌BWL-ABW的2′-FL摇瓶产量为3.92g/L，乳糖转化率为0.81mol2′-FL/mol。 （3）提高岩藻糖基转移酶的表达：在工程菌BWL基因组上利用CRISPR-Cas9双质粒系统整合上单拷贝的α1,2-岩藻糖基转移酶WbgL，以强化岩藻糖基化活力，促进2′-FL的生物合成，重组工程菌BWLW-ABW的2′-FL摇瓶产量提升为6.57g/L，乳糖转化率为0.89mol2′-FL/mol。 （4）强化GDP-L-岩藻糖合成通路酶的表达：在工程菌BWLW基因簇manC-manB和gmd-wcaG前整合上强组成型启动子J23119，通过转入不同的质粒组合得到九种工程菌，经摇瓶发酵，2′-FL摇瓶产量最高可达9.06g/L，乳糖转化率为0.90mol2′-FL/mol。 （5）高密度分批补料发酵：为进一步提高2′-FL的产量，本研究对重组工程菌BWLWC-3进行了分批补料发酵。发酵结果显示，经过3L发酵罐54.5h的分批补料发酵，2′-FL产量达到79.23g/L，乳糖转化率为0.864mol2′-FL/mol，OD600达到96.4。
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