摘要
目的 双酚A(BisphenolA,BPA)作为单体被广泛用于环氧树脂和聚碳酸酯塑料的生产，并通过食品和饮料的储存容器、医疗设备、餐具、运动设备、牙科密封剂等途径进入人体和环境。有研究已经表明，BPA及其相应的代谢产物可通过内分泌干扰作用，对机体生殖、免疫系统产生毒性影响，并能够穿过血脑屏障对发育中的大脑产生神经毒性作用，进而对行为、认知功能产生影响。海马的长时程增强(Long-termpotentiation,LTP)是学习记忆的重要神经生物学基础。突触后膜的N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartatereceptor,NMDAR)在LTP的诱导和维持中具有重要作用。D-丝氨酸(D-serine,D-ser)是NMDAR重要内源性共激动剂，所以D-ser在海马中的正常代谢至关重要。然而，机体暴露于BPA后对海马中D-ser代谢过程具体机制尚不清楚，待进行深入研究。因此，本研究通过建立孕期大鼠暴露的不同剂量BPA的动物模型，从D-ser合成、代谢和转运方面出发，通过检测丝氨酸消旋酶(serineracemase,SR)、D-氨基酸氧化酶(D-aminoacidoxidase,DAAO)、Na+非依赖型转运体:丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运体(alanine-serine-cysteinetransporter-1,asc-1)、Na+依赖型转运体:丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-苏氨酸(alanine-serine-cysteine-threonine,ASCT)转运体亚型ASCT1及ASCT2的基因和蛋白表达水平，研究孕期BPA暴露对不同发育阶段子代大鼠海马D-ser代谢的影响。随后建立孕期大鼠BPA染毒模型，对子代大鼠外源性腹腔注射L-ser和D-ser,通过水迷宫试验观察子代大鼠学习记忆能力。本研究探讨D-ser在BPA损害学习记忆能力中的作用以及外源性给予L-ser和D-ser对母体孕期BPA暴露所致子代学习记忆能力损伤的可能保护作用，可为深入阐明BPA暴露所致子代学习记忆损伤机制提供新的研究思路与数据。 方法 一、孕期BPA暴露对子代大鼠海马组织中D-ser代谢影响 1、选取SPF级健康SD大鼠共90只，雌鼠60只，雄鼠30只。适应性饲养一周，按雌雄比2∶1进行合笼，第二天清晨对雌鼠进行阴道涂片检测是否有精子，以检测到精子为确认妊娠标准，记为怀孕第(Gestationday,GD)0天。将孕鼠随机分为五组，GD5到GD19以5mL/kg容积灌胃染毒，灌胃BPA浓度分别为0、0.05、0.5、5和50mg/kg/dayBPA溶于玉米油。在GD20阶段每组随机选取6只孕鼠行剖腹产手术，取GD20胎鼠脑组织和海马组织，剩余6只孕鼠饲养至自然分娩;子代大鼠于出生后(Postnatalday,PND)21天断乳，正常饮食水饲养至PND56实验结束,分别于PND21和PND56取子代大鼠海马组织和脑组织，进行后续实验。 2、通过HPLC-MS检测三个阶段子代大鼠脑内BPA含量，检测三个阶段子代大鼠海马中L-ser和D-ser含量。 3、通过HE染色观察PND21和PND56子代大鼠海马组织形态学变化。 4、通过Real-timePCR和Westernblot分别检测三个阶段子代大鼠海马组织中SR、DAAO、asc-1、ASCT1和ASCT2的基因与蛋白表达情况。 二、L-ser和D-ser对母体孕期BPA暴露所致子代大鼠学习记忆能力损伤的影响 1、选取SPF级健康SD大鼠共72只，雌鼠48只，雄鼠24只。适应性养一周，按雌雄比2∶1进行合笼，第二天清晨对雌鼠进行阴道涂片检测是否有精子,以检测到精子为确认妊娠标准，记为GD0天。将孕鼠随机分为8组，GD5到GD19以5mL/kg容积，5mg/kg/dayBPA浓度进行灌胃染毒，将孕鼠饲养至自然分娩，子代大鼠正常饮食水饲养至PND49,以3mL/kg容积腹腔注射给予生理盐水、L-ser(40mg/kg和80mg/kg)及D-ser(40mg/kg和80mg/kg)至PND56,具体分组信息如下:阴性对照组(母鼠灌胃玉米油，子代大鼠腹腔注射生理盐水)、干预剂对照组(母鼠灌胃玉米油，子代大鼠腹腔注射80mg/kgL-ser或80mg/kgD-ser)、BPA组(母鼠灌胃5mg/kg/dayBPA,子代大鼠腹腔注射生理盐水)、BPA+低剂量干预剂组(母鼠灌胃5mg/kg/dayBPA,子代大鼠腹腔注射注射40mg/kgL-ser或40mg/kgD-ser）、BPA+高剂量干预剂组（母鼠灌胃5mg/kg/dayBPA,子代大鼠腹腔注射注射80mg/kgL-ser或80mg/kgD-ser）。 2、子代大鼠于PND56起进行水迷宫试验检测其学习记忆能力，水迷宫试验后，在PND62处理实验动物，取脑组织，剥离海马组织，称量脑组织及海马组织湿重，分别计算脏器系数。 结果 一、母体孕期BPA暴露对子代大鼠海马组织中D-ser代谢影响 1、在GD20阶段，5和50mg/kg/day孕期BPA暴露组子代大鼠体重和脑重低于对照组（P＜0.05）,脑组织脏器系数、海马重和海马组织脏器系数与对照组相比无明显改变（P＞0.05）;PND21和PND56阶段，各孕期BPA暴露组子代大鼠体重、脑重、脑组织脏器系数、海马重和海马组织脏器系数均无明显改变（P＞0.05）。 2、HPLC-MS结果显示:在GD20阶段，与对照组相比，5和50mg/kg/day孕期BPA暴露组子代大鼠脑中BPA含量显著升高（P＜0.05）;在PND21和PND56阶段，与对照组相比，0.5、5和50mg/kg/day孕期BPA暴露组子代大鼠脑中BPA含量均显著升高（P＜0.05）。 3、HE染色结果显示:孕期高剂量BPA暴露可使子代大鼠海马组织中神经元数量减少，形态结构出现异常。 4、HPLC-MS结果显示:在GD20阶段，与对照组相比，所有BPA暴露组子代大鼠海马组织中L-ser含量均显著升高（P＜0.05）,D-ser含量自0.5mg/kg/dayBPA暴露组开始显著升高（P＜0.05）;在PND21阶段，5和50mg/kg/day孕期BPA暴露组子代大鼠海马组织中L-ser显著升高（P＜0.05）,各暴露组子代大鼠海马组织中D-ser降低（P＜0.05）;在PND56阶段，与对照组相比，各BPA组子代大鼠海马组织中L-ser含量和D-ser含量均显著降低（P＜0.05）。 5、SR表达结果显示:在GD20阶段，与对照组相比，当BPA暴露剂量大于等于0.5mg/kg/day时，子代大鼠海马组织中SR蛋白水平显著降低（P＜0.05）;在PND21阶段，孕期50mg/kg/dayBPA暴露组子代海马组织中SR基因水平及自0.5mg/kg/dayBPA暴露组起的SR蛋白表达均降低（P＜0.05）;在PND56阶段，所有剂量BPA暴露组SR基因和蛋白表达均降低（P＜0.05）。 6、DAAO表达结果显示:在GD20阶段，除0.05mg/kg/dayBPA暴露组DAAO基因表达水平外，各BPA暴露组DAAO基因和蛋白表达水平均显著高于对照组（P＜0.05）;在PND21阶段，除0.05mg/kg/dayBPA暴露组DAAO蛋白表达水平外，各暴露组DAAO基因和蛋白表达水平均显著低于对照组（P＜0.05）;在PND56阶段,各BPA暴露组DAAO蛋白表达水平均显著低于对照组（P＜0.05）,同时只有50mg/kg/dayBPA暴露组DAAO基因表达水平明显降低（P＜0.05）。 7、asc-1表达结果显示:在GD20阶段，与对照组相比，各BPA暴露组asc-1基因表达均显著降低（P＜0.05）,5和50mg/kg/dayBPA暴露组asc-1蛋白表达显著降低（P＜0.05）;在PND21阶段，与对照组相比，各暴露组子代大鼠海马组织中asc-1基因和蛋白表达水平均降低（P＜0.05）;在PND56阶段，除0.05mg/kg/dayBPA暴露组子代大鼠海马组织中asc-1基因表达水平无明显变化外（P＞0.05）,其他各BPA暴露组子代大鼠海马组织中asc-1基因和蛋白水平均降低（P＜0.05）。 8、ASCT1表达结果显示:在GD20阶段和PND21阶段，50mg/kg/dayBPA暴露组ASCT1蛋白表达显著升高（P＜0.05）,0.5、5和50mg/kg/dayBPA暴露组ASCT1基因表达明显升高（P＜0.05）;在PND56阶段，各暴露组ASCT1基因和蛋白表达与对照组相比均显著升高（P＜0.05）。 9、ASCT2表达结果显示:在GD20阶段，除0.05mg/kg/dayBPA暴露组ASCT2蛋白表达水平与对照组相比无明显变化外（P＞0.05）,其他各暴露组ASCT2基因和蛋白表达水平均降低（P＜0.05）;在PND21阶段，50mg/kg/dayBPA暴露组ASCT2蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）,各暴露组ASCT2基因表达水平均与对照组相比明显降低（P＜0.05）;在PND56阶段，50mg/kg/dayBPA暴露组ASCT2蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）,此外，自0.5mg/kg/dayBPA暴露组起ASCT2基因表达水平与对照组相比显著降低（P＜0.05）。 二、L-ser和D-ser对母体孕期BPA暴露所致子代大鼠学习记忆能力损伤的影响 1、母体孕期BPA暴露，子代大鼠给予L-ser和D-ser后，体重、脑重、脑组织脏器系数、海马重和海马组织脏器系数变化均无统计学意义（P＞0.05）。 2、水迷宫试验结果显示:在定位航行试验的5天训练中，单纯BPA暴露组子代大鼠逃避潜伏期均长于阴性对照组和干预剂对照组;在训练第1天，BPA+40mg/kgL-ser组、BPA+80mg/kgL-ser组、BPA+40mg/kgD-ser组及BPA+80mg/kgD-ser组子代大鼠逃避潜伏期均长于阴性对照组和干预剂对照组;在训练第2天，BPA+40mg/kgL-ser组、BPA+80mg/kgL-ser组、BPA+40mg/kgD-ser组及BPA+80mg/kgD-ser组子代大鼠逃避潜伏期明显长于阴性对照组，同时也明显低于单纯BPA暴露组，其中BPA+80mg/kgL-ser组子代大鼠逃避潜伏期明显长于干预剂对照组;在训练第3天，BPA+40mg/kgL-ser组、BPA+80mg/kgL-ser组、BPA+40mg/kgD-ser组及BPA+80mg/kgD-ser组子代大鼠逃避潜伏期明显长于阴性对照组，同时也显著短于单纯BPA暴露组（BPA+40mg/kgD-ser组与阴性对照组差异无统计学意义）;在训练第4和5天，BPA+40mg/kgL-ser组、BPA+80mg/kgL-ser组、BPA+40mg/kgD-ser组及BPA+80mg/kgD-ser组子代大鼠逃避潜伏期明显短于单纯BPA暴露组。在空间探索试验中，单纯BPA暴露组在第二象限停留时间明显低于阴性对照组（P＜0.05）;同时，BPA+40mg/kgL-ser组、BPA+80mg/kgL-ser组、BPA+40mg/kgD-ser组及BPA+80mg/kgD-ser组子代大鼠在第二象限停留时间明显高于单纯BPA暴露组（P＜0.05）。 结论 1.母体孕期BPA暴露可提高GD20及PND21阶段子代大鼠海马中L-ser水平、降低成熟期海马中L-ser水平;可提高GD20阶段海马中D-ser水平，而自PND21起降低海马中D-ser水平。 2.母体孕期BPA暴露可不同程度地使海马中SR、DAAO、asc-1、ASCT1和ASCT2的基因和蛋白表达水平发生变化，进而引起D-ser代谢紊乱。 3.外源性给予子代大鼠L-ser和D-ser,可有所改善孕期暴露BPA所致的子代大鼠学习记忆损伤。
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