利用CRISPR/Cas9基因编辑技术优化玉米大斑病菌基因敲除体系

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中文摘要：玉米不仅是人类重要的粮食资源，也是工业原材料和牲畜饲料的原料来源。玉米大斑病是玉米上一种重要的叶部病害，玉米大斑病菌（Exserohilumturcicum）是引起玉米大斑病的丝状病原真菌,主要通过产生附着胞利用机械压力穿透植物组织侵入寄主。目前对于玉米大斑病菌的基因功能研究，多通过RNAi技术在mRNA水平上降低目标基因的表达，并没有实现目标基因在DNA水平上的敲除。同源重组技术是用于丝状真菌基因敲除的一种重要手段，但是其在玉米大斑病菌上敲除基因的效率极低。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术可以提高丝状真菌的同源重组效率，因此我们拟将CRISPR/Cas9技术和同源重组技术结合，通过Cas9蛋白和sgRNA的体外结合得到Cas9RNPs，利用PEG介导的转化方法将有效靶向目标位点的Cas9RNPs导入到真菌原生质体中，以期开发并优化了一种适用于玉米大斑病菌基因敲除的方法。本研究首先对玉米大斑病菌产孢条件进行了优化，同时对玉米大斑病菌原生质体的制备方法进行优化，在优化玉米大斑病菌遗传转化体系的基础上，利用基因编辑技术对玉米大斑病菌3HNR基因、URA5基因进行敲除，通过PCR及测序检测编辑结果，以期利用CRISPR/Cas9基因编辑技术优化玉米大斑病菌基因敲除体系，为玉米大斑病菌基因功能研究奠定基础。本论文主要研究结果如下： 1.玉米大斑病菌原生质体制备体系的优化通过对玉米大斑病菌产孢条件优化，确定了在25℃全黑暗条件下玉米大斑病菌在V8蔬菜汁固体培养基上培养25d时产孢量较多，约4.8×106个/mL；分生孢子收集的最适方法为吸头刮取方法。通过对玉米大斑病菌原生质体制备方法的优化，明确了溶壁酶、崩溃酶和蜗牛酶三种酶混合液在酶解时与菌丝的最佳比例为1：1，在28℃，100rpm下，酶解时间约4h时可释放原生质体数量最大。 2.sgRNA编辑效率的测定及Cas9RNPs的组装通过试剂盒体外转录了sgRNA，对NLSH2BCas9Rosetta（DE3）菌株进行Cas9蛋白纯化。调整Cas9：sgRNA：PCRfragment质量比为10∶10∶1进行体外切割实验，测定不同sgRNA的编辑效率。通过形成Cas9RNPs方法以实现基因编辑：将Cas9蛋白和sgRNA在体外组装形成稳定的RNP，然后通过PEG介导转化将该复合物转移到玉米大斑病菌原生质体中进行基因编辑。 3.通过抗性培养基筛选及PCR对获得的转化子进行验证对3HNR基因进行编辑，我们获得了阳性转化子约300个，其中在PDA-HYG抗性培养基上生长，具有潮霉素抗性的有21个转化子，但我们进行PCR验证时并未验证到潮霉素基因的插入，后经测序并未检测到靶点敲除；对URA5基因进行编辑，我们获得阳性转化子约75个，在5-FOA营养缺陷型培养基上进行筛选得到7个阳性转化子，但经测序同样未检测到靶点敲除。综上所述，本研究在优化玉米大斑病菌原生质体制备体系的基础上，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术优化玉米大斑病菌敲除体系，实现了CRISPR/Cas9技术在玉米大斑病菌上的初步探索，为今后进一步完善其基因编辑技术体系打下基础。

作者：

刘靖愉

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关键词：

玉米大斑病菌 CRISPR/Cas9 3HNR URA5 基因编辑

授予学位：

硕士

学科专业：

资源利用与植物保护

导师：

胡莹

学位年度：

2023

学位授予单位：

吉林农业大学

语种：

中文

中图分类号：