摘要
背景： 变应性鼻炎(allergicrhinitis，AR)平均发病率为10%?50%，全球至少有6亿人受变应性鼻炎的困扰。中医药治疗AR在于从患者机体整体出发，纠正阴阳失衡的疾病状态，能多系统，多靶点作用于机体，具有远期疗效较稳定、不易复发的疗效优势。近年来，随着“卫生假说”扩展到“老朋友”假说和“微生物群落”假说，肠道微生物群在AR发病和防治过程中的关键作用正逐渐被揭示,进一步的研究发现，肠道微生物群可通过多种方式参与宿主免疫系统的调节，因此部分学者开始尝试以肠道微生物群为治疗靶点，如通过补充益生菌维持肠道稳态，探究其对变应性疾病的预防及治疗作用。因此，调控肠道微生物群可能是AR很有前景的治疗手段。 摄涕止鼽方是成都中医药大学彭顺林教授治疗肺气虚寒AR的临床经验方，该方药在临床上治疗常年性及季节性肺气虚寒型AR患者均取得了较理想的疗效。摄涕止鼽方作为中药复方化学成分复杂，在这些复杂的中药成分中有相当一部分成分口服生物利用低下，难以被吸收入血，这导致血液中的浓度水平有限。从表面上看，这些成分未能被小肠吸收。实际上，中药中部分难以被小肠吸收的成分会同结肠微生物群发生直接接触及相互作用。“卫生假说”的发展及现代医学提出了“肠-肺轴”的理念,强调了肠道微生物群和呼吸道疾病之间的相互联系。本研究团队前期研究表明，摄涕止鼽方可纠正AR患者Th17/Treg细胞因子网络的失衡状态。此外，进一步的研究发现肠道微生物群及其代谢产物可以调控Th17/Treg平衡。据此，我们提出假说：摄涕止鼽方具有调控肠道微生物群的能力，进一步影响Th17/Treg细胞平衡而发挥治疗AR的作用。 围绕此假说，本研究通过卵清蛋白（ovalbumin，OVA）＋氢氧化铝（Aluminumhydroxide,Al(OH)3）建立AR模型大鼠来研究肠道菌群与AR病理进程的关系，通过对行为学观察、鼻黏膜组织病理学观察及血清中特异性IgE的水平来评判AR大鼠模型及摄涕止鼽方的药效学作用；通过检测结肠菌群组成和含量，外周血中Th17及Treg细胞数量及相关细胞因子的表达，探究摄涕止鼽方是否通过“肠道微生物群-Th17/Treg”轴防治AR。 目的: 临床与实验研究表明摄涕止鼽方（She-Ti-Zhi-Qiudecoction,STZQ）治疗肺气虚寒型AR疗效显著。近期研究发现，AR的发病机制与肠道微生物群及Th17/Treg平衡密切相关，靶向肠道微生物群可有效防治AR。本研究主要探究STZQ通过调控肠道菌群，进一步影响Th17/Treg平衡而达到治疗AR的目的。 方法: 28只6-8周龄雌性SD大鼠饲养1周后，采用OVA＋Al(OH)3诱导激发构建AR大鼠模型，用EXCEL生成随机数字表，采用余数法进行随机分组，将28只大鼠随机分为4组。分别为空白对照组（Control组）、AR模型组（Model组）、中药组（STZQ组）、益生菌组（Probiotics组）。Control组及Model组予以生理盐水灌胃，STZQ组予以摄涕止鼽方灌胃，Probiotics组予以益生菌灌胃。各组大鼠予以灌胃14天后采集大鼠鼻黏膜、血清、外周血、结肠内容物。通过观察大鼠AR典型症状对行为学进行评价；通过苏木精-伊红染色（Hematoxylin-eosinstaining，HE）评估鼻黏膜组织病理；通过16SrDNA测序检测并分析结肠内容物中细菌的结构及含量；运用流式细胞术（flow cytometer，FCM）检测外周血单个核细胞中调节性Ｔ细胞（Regulatorycells，Treg）及辅助性细胞17（Thelpercell17，Th17）的相对比例；运用酶联免疫吸附试验（EnzymeLinkedImmunoadsorptionAssay，ELISA）检测血清中Th17细胞及Treg细胞相关细胞因子水平；运用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-timePCR，RT-PCR），检测Foxp3mRNA及RORγtmRNA的表达，运用蛋白质印迹法（WesternBlot，WB）检测Foxp3及RORγt的蛋白表达，探讨肠道微生物群在摄涕止鼽方防治AR疗效机制中的作用。 结果: 1．AR典型症状评分，鼻黏膜病理组织，血清OVA-sIgE:与对照组（Control组）相比，模型组（Model组）AR典型症状评分显著升高(plt;0.05)，大鼠鼻黏膜病理组织炎性改变，血清OVA-sIgE显著升高(plt;0.05)，提示采用OVA+Al(OH)3致敏建立AR大鼠模型成功；摄涕止鼽方干预显著降低AR典型症状评分(plt;0.05)，改善了鼻黏膜组织炎性严重程度，下调血清OVA-sIgE水平(plt;0.05)。 2．Th17/Treg平衡的相关指标：摄涕止鼽方可以降低AR大鼠模型血清中IL-17A水平，下调鼻黏膜RORγtｍRNA表达及鼻黏膜RORγt蛋白表达，降低外周血中CD3+CD8-IL17A+Th17细胞数量；升高血清中IL-10水平，上调鼻黏膜Foxp3ｍRNA表达及鼻黏膜Foxp3蛋白表达，升高外周血中CD4＋CD25＋Foxp3+Treg细胞数量。 3．结肠微生物菌群检测： 3.1物种注释：Control组、Model组、STZQ组和Probiotics组分别有2077、3245、1606、2310个OTU。四个实验组共用的OTU数目为228种，Control组特有OTU有1147种，Model组特有OTU有2009种，STZQ组特有的OTU有884种，Probiotics组特有的OTU有1284种。分析结果表明造模及给药后实验大鼠肠道中菌群种类变化明显。 3.2物种丰富度：相比Control组，Model组肠道菌群丰富度增加，STZQ及Probiotics干预后物种丰富度下降，使之趋于Control组。 3.3群落多样性：四组（Control组、Model组、STZQ组、Probiotics组）肠道菌群多样性无统计学差异。 3.4组间肠道菌群异同：在门水平：STZQ可以上调Firmicutes(厚壁菌门)，下调Spirochaetes(螺旋体门)、Bacteroidetes（拟杆菌门）丰度（plt;0.05）；在目水平：STZQ可以下调Enterobacteriales（肠杆菌目）丰度（plt;0.05）；在科水平：STZQ及Probiotics可在下调g_unidentified_S24-7及Enterobacteriaceae（肠杆菌科）丰度（plt;0.05）；在属水平：STZQ及Probiotics可在下调Unidentified_S24-7及Oscillospira（颤螺菌属）丰度（plt;0.05）。 3.5肠道菌群与生物学指标的相关性：STZQ升高肠道菌群Firmicutes(厚壁菌门)的丰度，下调Spirochaetes（螺旋体门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Enterobacteriales（肠杆菌目）、S24-7、Enterobacteriaceae（肠杆菌科）、Unidentified_S24-7及Oscillospira（颤螺菌属）丰度，相关性分析结果显示，上述差异菌属Firmicutes(厚壁菌门)与IL-10呈正相关;Spirochaetes(螺旋体门)、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Enterobacteriales（肠杆菌科）、S24-7、Unidentified_S24-7与Oscillospira（颤螺菌属）与IL-10呈负相关；Ruminococcaceae（瘤胃球菌科）、S24-7、Unidentified_S24-7、Oscillospira（颤螺菌属）与IL-17A、IL-17E呈正相关。 结论: 1．OVA+Al(OH)3致敏建立AR大鼠模型成功，摄涕止鼽方可缓解AR模型大鼠典型症状，改善鼻黏膜组织炎性严重程度，下调血清OVA-sIgE水平，药效学作用明确； 2．摄涕止鼽方可下调AR模型大鼠结肠菌群丰富度，使之趋于Control组，对菌群多样性无影响； 3．摄涕止鼽方可重塑肠道菌群结构，影响外周血Th17/Treg平衡及相关细胞因子的表达，并且菌群结构变化与血清IL-17A、IL-17E、IL-10具有相关性。提示摄涕止鼽方可能通过调控“肠道微生物群-Th17/Treg”轴达到治疗AR的目的。
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