研究背景和目的: 痛风是单钠尿酸盐(Monosodiumurate,MSU)晶体沉积所致的晶体相关性疾病。急性痛风性关节炎(Acutegoutyarthritis,AGA)是痛风首发症状。中性粒细胞在AGA发生发展中发挥着关键作用，中性粒细胞浸润是AGA典型的病理标志之一。课题组前期研究发现升麻及其单体能够调控中性粒细胞抗类风湿性关节炎(Rheumatoidarthritis,RA),但升麻是否能够调控中性粒细胞抗AGA尚未见报道。本课题的研究拟以中性粒细胞为切入点，采用小鼠AGA改良模型,研究升麻调控中性粒细胞抗AGA的作用机制，并基于网络药理学探讨升麻治疗痛风的潜在分子机制，为升麻抗AGA提供实验依据，为痛风相关疾病基础与临床研究提供理论依据。 研究方法: 1小鼠AGA模型的改良 传统方法采用1mL无菌注射器沿小鼠右踝关节外侧后方垂直进针穿刺，注射研磨的MSU晶体混悬液至右踝关节内;改良方法采用0.3mL注射器注射研磨并用40μM细胞过滤器过滤的MSU晶体混悬液;对照组采用0.3mL注射器，按上述方法注射等体积无菌生理盐水。1)从右踝关节肿胀度、肿胀照片评价造模方法对AGA小鼠右踝关节肿胀的影响;2)采用HE染色观察造模方法对AGA小鼠右踝关节组织病理的影响。 2升麻调控中性粒细胞抗AGA的作用机制研究 2.1升麻抗AGA的疗效评价 采用改良的小鼠AGA模型，分别给予秋水仙碱(0.83mg·kg-1)、升麻(2g·kg-1)干预，造模7d后取材。从右踝关节肿胀度评价秋水仙碱和升麻对AGA小鼠右踝关节肿胀的影响;采用HE染色、骨密度仪扫描、Micro-CT等检测秋水仙碱和升麻对AGA小鼠右踝关节组织病理、骨质破坏的影响。 2.2筛选升麻抗AGA的单体 采用液相色谱-质谱联用(HighPerformanceLiquidChromatography-MassSpectrometry,HPLC-MS)对升麻的成分异阿魏酸(Isoferulicacid,IFA)、黄肉楠碱和脱氧升麻亭(23-EPI-26-deoxyactein,23-EPI)进行鉴定。制备改良的小鼠AGA模型，分别给予秋水仙碱、升麻以及异阿魏酸(5mg·kg-1)、黄肉楠碱(5mg·kg-1)和脱氧升麻亭(5mg·kg-1）干预，造模7d后取材。从右踝关节肿胀度评价秋水仙碱、升麻、异阿魏酸、黄肉楠碱和脱氧升麻亭对AGA小鼠右踝关节肿胀的影响，并筛选出升麻抗AGA的有效单体。 2.3升麻及其单体黄肉楠碱体内对中性粒细胞的影响 秋水仙碱、升麻以及升麻单体黄肉楠碱干预改良的AGA模型小鼠，18h后取材。采用HE染色观察升麻和黄肉楠碱对AGA小鼠右踝关节组织病理的影响;采用ELISA检测AGA小鼠外周血中炎症因子含量;采用流式细胞术检测升麻和黄肉楠碱对AGA小鼠外周血粒细胞的比例和单核细胞比例的影响;采用PicoGreen法检测升麻和黄肉楠碱对AGA小鼠外周血中cf-DNA含量的影响;采用Real-timePCR检测升麻和黄肉楠碱对AGA小鼠右踝关节组织炎症因子、趋化因子表达的影响;采用ELISA检测升麻和黄肉楠碱对AGA小鼠右踝关节组织蛋白中炎症因子含量的影响。 2.4升麻及其单体黄肉楠碱调控中性粒细胞的体外机制研究 检测SD大鼠制备的升麻含药血清和黄肉楠碱对骨髓中性粒细胞活化的影响,包括CXCL1,CXCL2和CCL3诱导趋化，对LPS或PMA联合MSU刺激的吞噬功能、培养上清中炎性细胞因子分泌、活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)生成、培养上清游离DNA(CellfreeDNA,cf-DNA)含量以及早期凋亡的影响。 3应用网络药理学探讨升麻治疗痛风的潜在分子机制 采用TTD,DrugBank和DisGeNet疾病数据库对痛风靶点进行筛选;采用TCMSP数据库和SwissTargetPrediction对升麻进行成分的筛选以及升麻成分靶点的预测，绘制升麻成分靶点与痛风靶点韦恩图;采用Cytoscape对升麻成分和痛风治疗潜在靶点进行蛋白与蛋白互作(Protein-ProteinInteraction,PPI)网络构建与拓扑分析;对升麻成分治疗痛风的潜在靶点进行基因本体论(GeneOntology,GO)功能富集分析与Reactome信号通路富集分析;采用Cytoscape构建“升麻成分-痛风靶点-信号通路”PPI网络图。 研究结果: 1小鼠AGA模型的改良 改良后的AGA小鼠造模方法避免了MSU晶体颗粒堵塞针头、退针时漏液,减少肿胀度组内差异，减少关节骨质破坏。 2升麻调控中性粒细胞的机制研究 2.1升麻抗AGA的疗效评价 升麻缓解AGA模型小鼠的右踝关节肿胀、减轻关节滑膜组织增生。 2.2筛选升麻抗AGA的单体 升麻水煎液含有异阿魏酸、黄肉楠碱和脱氧升麻亭3个成分。升麻及其单体异阿魏酸、黄肉楠碱和脱氧升麻亭能够缓解AGA小鼠的右踝关节肿胀，黄肉楠碱的效果优于其他单体。 2.3升麻及其黄肉楠碱体内对中性粒细胞的影响 升麻和黄肉楠碱能够减轻AGA模型小鼠踝关节组织中性粒细胞浸润，减少坏死面积;降低血浆中cf-DNA水平;降低关节组织IL-1β,TNF-α和IL-6,CXCL1,CXCL2,CCL3和IL-8的mRNA表达以及关节组织IL-1β,TNF-α和IL-6蛋白水平。 2.4升麻及其黄肉楠碱调控中性粒细胞的体外机制研究 升麻含药血清和黄肉楠碱可以抑制CXCL1诱导的中性粒细胞趋化;抑制IL-1β,TNF-α和IL-6分泌，抑制cf-DNA释放，促进中性粒细胞凋亡。升麻含药血清抑制CCL3诱导的中性粒细胞趋化，降低CD88的表达，抑制中性粒细胞产生ROS。 3应用网络药理学探讨升麻治疗痛风的潜在分子机制 经过数据库筛选得到326个痛风相关靶点;经过数据库筛选得到16个升麻成分，625个升麻成分潜在靶点;韦恩图显示53个升麻治疗痛风的潜在靶点;对升麻成分和痛风治疗潜在靶点PPI网络构建与拓扑分析可得，R值分值最高的5个成分与自由度排序前五的靶点;GO功能和Reactome信号通路富集分析显示升麻通过多种代谢过程和炎症反应通路对痛风产生影响;“升麻成分-痛风靶点-信号通路”PPI网络图显示升麻的多种有效成分是通过多靶点、多信号通路共同起到治疗痛风的作用。 结论: 1.改良的小鼠AGA模型是一种稳定可靠的动物模型，避免了造模导致的模型不稳定性和非单因素致病的弊端。 2.升麻具有抗AGA的疗效。升麻3个单体异阿魏酸、黄肉楠碱和脱氧升麻亭都是抗AGA的有效单体。黄肉楠碱抗AGA的效果最优。 3.升麻和黄肉楠碱调控中性粒细胞的浸润和功能抗AGA。 4.升麻含有多种有效成分，这些成分通过多条传导信号通路作用于痛风的多个靶点，发挥治疗痛风的作用。
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