摘要
芍药为芍药科（Paeoniaceae）芍药属（Paeonia）草本植物，作为中国的传统花卉，具有很高的观赏价值，且切花生产发展前景广阔。但是，由于芍药自然花期集中在春夏季，且切花瓶插寿命较短，因此难以满足人们多样化的观赏需求。生产中，由于对有关芍药鲜切花保鲜抗衰老机理尚不够清晰，限制了芍药鲜切花的生产规模。本研究对不同芍药品种花衰老过程中主要内源激素等生理指标进行测定，并在此基础上研究了芍药内源激素合成相关转录因子的功能，探讨了芍药花衰老过程中内源激素的分子调控网络，还探索了应用VIGS（病毒诱导基因沉默）技术及瓶插保鲜液延长芍药瓶插寿命的方法。整个研究以期明确内源激素对芍药花衰老的调控机制，探索新的芍药切花保鲜生物技术方法，旨在为芍药鲜切花生产提供理论和技术参考。现将主要研究结果报告如下： 1.测定‘科拉露易丝’、‘香茉儿’、‘莲台’等25个不同芍药品种花衰老相关生理指标，并分析它们之间的相互关系。根据花衰老过程中乙烯含量的变化，可将芍药分为3种类型：乙烯跃变型、乙烯非跃变型及末期上升型。在乙烯跃变型芍药品种中，花衰老过程伴随着脱落酸（ABA）与乙烯的大量生成，且ABA峰值的出现早于乙烯峰值；在乙烯非跃变型芍药品种中，乙烯在整个花衰老过程中含量变化不明显，但ABA含量会出现峰值，且峰值出现时期晚于乙烯跃变型芍药品种花衰老过程中ABA峰值出现的时期；在末期上升型芍药品种中，乙烯含量随着花衰老过程逐渐上升，ABA含量在初衰期达到峰值。在25个芍药品种中，GA含量均呈现先升高后降低的趋势。结合以上结果，我们推测在乙烯跃变型芍药品种以及末期上升型芍药品种中，ABA是启动花衰老的激素，ABA含量的升高会促进乙烯的释放，而乙烯的大量产生会加速花朵的衰老；在乙烯非跃变型芍药品种中，ABA是促进花朵衰老的关键激素，乙烯对于花衰老的作用不强。ABA或乙烯的大量产生可能会抑制GA的合成。丙二醛（MDA）含量及膜透性随着花朵的衰老而加大，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性在花朵盛开期之前保持在高水平，盛开期后活性下降。SOD、CAT活性与MDA含量及膜透性呈负相关，说明活性氧的产生与清除失衡导致的细胞膜受损加速了切花的衰老。相关性分析结果表明，可溶性糖和可溶性蛋白含量与ABA含量呈显著正相关，因此，我们推测ABA可能影响可溶性糖和可溶性蛋白的积累。 2.对之前芍药花衰老相关转录组数据中筛选出的可能参与花衰老进程的锌指蛋白转录因子PlZFP功能进行了研究。PlZFP的沉默延缓了‘杭芍’花瓣盘的衰老速度而PlZFP的过表达加速了烟草花朵的衰老速度。PlZFP沉默后第四天，‘杭芍’花瓣盘中GA含量约为空载对照的1.25倍，而ABA，乙烯含量分别下降为空载对照的0.73倍和0.39倍；PlZFP过表达后第5天，转基因烟草花中GA含量下降为野生型的0.71倍，而ABA，乙烯含量分别升高为野生型的2.08倍和1.64倍。PlZFP沉默后的‘杭芍’花瓣盘中内源激素合成途径关键结构基因PlGA3ox1表达量上升为空载的2.45倍；PlACO1、PlACO3、PlACS1、PlNCED2表达量分别下降为空载的0.22倍、0.3倍、0.65倍、0.29倍。PlZFP过表达的烟草花冠中，NtGA3ox1表达量下降为野生型的0.36倍，NtACO1、NtACO3、NtACS1、NtNCED2、NtAAO表达量分别升高为野生型的2.67倍、1.69倍、1.74倍、1.78倍、1.43倍。双荧光素酶实验和酵母单杂交实验结果表明，PlZFP可以特异性结合PlNCED2（ABA生物合成途径关键结构基因）启动子。对PlNCED2进行功能分析发现，沉默PlNCED2延缓了‘杭芍’花瓣的衰老速度，且延缓效果与外源施加ABA抑制剂的效果相似。外源激素处理实验发现，外源施加ABA、多效唑（PAC）和乙烯利（Ethephon）会使本该出现衰老延缓现象的PlZFP沉默‘杭芍’花瓣盘衰老速度加快。以上结果表明PlZFP转录因子通过调节下游ABA生物合成途径关键结构基因PlNCED2的表达参与花衰老，且PlZFP转录因子可能参与芍药花衰老进程中ABA，乙烯与GA间的相互作用网络。 3.对之前芍药花衰老相关转录组数据中筛选出的可能参与芍药花衰老进程的MYB转录因子PlMYB308进行功能研究。PlMYB308沉默延缓了‘杭芍’花瓣盘的衰老速度。PlMYB308沉默后第四天，‘杭芍’花瓣盘中GA含量约为空载对照的1.58倍，而ABA，乙烯含量分别下降为空载对照的0.62倍和0.75倍。PlMYB308在烟草中的异源过表达加速了花朵的衰老速度。PlMYB308过表达后第5天，烟草花中GA含量下降为野生型的0.74倍，而ABA，乙烯含量分别升高为野生型的1.68倍和2.08倍。在PlMYB308沉默的花瓣盘及过表达的烟草花中检测内源激素生物合成途径基因的表达量变化，发现PlGA3ox1、PlACO1、PlACO3、PlACS1、PlNCED2的表达量受PlMYB308表达量变化的影响。双荧光素酶和酵母单杂交实验结果表明，PlMYB308特异性结合PlACO1（乙烯生物合成途径关键结构基因）启动子。对PlACO1进行功能验证，沉默PlACO1延缓‘杭芍’花瓣的衰老过程，且延缓效果与外源施加乙烯抑制剂的效果相似。此外，外源乙烯可以使本该出现衰老延缓现象的PlMYB308沉默‘杭芍’花瓣盘衰老速度加快，而1-MCP处理可以延缓PlMYB308过表达造成的花衰老加速现象。综上所述，PlMYB308转录因子可以通过调节下游乙烯生物合成途径关键结构基因PlACO1的表达参与花衰老。 4.通过对VIGS技术的优化以及切花保鲜剂组分浓度的筛选及配方的研究，延长乙烯跃变型芍药品种‘杭芍’的切花瓶插寿命。VIGS技术的优化中发现，开放程度为花蕾较软，花瓣松散的花朵最适宜作为VIGS侵染材料；真空侵染的VIGS方法可在不伤害切花的情况下沉默芍药花衰老相关转录因子PlZFP、PlMYB308，从而起到延长芍药切花瓶插寿命的作用。‘杭芍’切花保鲜剂的研究发现，糖、有机酸、无机盐、杀菌剂均可作为‘杭芍’切花保鲜剂的主要成分延长切花瓶插寿命。其中单一组分4%蔗糖，100mg/L柠檬酸、100mg/L硫酸铝（Al2(SO4)3）、200mg/L8-羟基喹啉（8-HQ）对于‘杭芍’瓶插寿命的延长效果最好。4%蔗糖+100mg/L柠檬酸+100mg/LAl2(SO4)3为最适宜的瓶插保鲜剂配方，经其处理后的‘杭芍’切花瓶插寿命比对照增加了23%天。VIGS技术结合瓶插保鲜剂处理可最大限度的延长芍药切花瓶插寿命，PlZFP沉默的芍药切花经4%蔗糖+100mg/L柠檬酸+100mg/LAl2(SO4)3瓶插保鲜剂处理可延长32%天的瓶插寿命。
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