摘要
溃疡性结肠炎(UlcerativeColitis,UC)是一种以结直肠黏膜层及黏膜下层损伤为主的连续性炎性肠道疾病，发病率在世界范围内呈上升趋势。UC患者肠黏膜屏障的破坏，使得肠道微生物与免疫细胞相互作用，从而引发失控的炎症反应,导致临床上UC难以治愈，只能缓解，迫切需要寻求新的治疗药物。青黛是临床治疗UC的有效药物之一，本草记载中明确了青黛具有止痢的效果，现代研究表明，其活性成分靛蓝、靛玉红是治疗UC的主要物质基础。靛玉红在抗炎和调节肠道菌群方面具有优势，靛蓝在免疫调节方面具有优势，两者合用可针对结肠炎的复杂发病机制，起到协同增效的作用。但靛蓝、靛玉红属于BCSⅣ类药物，溶解度和渗透性较差，口服生物利用度较低，限制了其临床疗效的发挥。另外,结肠黏液层是抵御外部威胁的关键生理屏障，也被认为是各种药物和药物载体给药途径的重要生物屏障，限制了药物有效传递到固有层调节炎性细胞的潜力。 因此，本研究基于“组分配伍，精准递送”的研究策略，以靛蓝-靛玉红为研究对象，优选治疗UC最佳配比，构建纳米晶体递药系统，以期阐明靛蓝-靛玉红组分配伍治疗UC的优效性与作用机制，解决靛蓝-靛玉红结肠黏液穿透与免疫靶向的递药难题，为精准把控中药的整体性和协同作用特点，设计符合UC病理特征的递药系统，创新现代中药制剂提供了基础。主要研究内容与结果如下: 1.靛蓝-靛玉红组分配伍治疗UC剂量和比例筛选 为筛选靛蓝-靛玉红组分配伍治疗UC的最佳剂量，通过体重变化、疾病活动指数(Thediseaseactivityindex,DAI)评分、结肠长度及病理切片考察靛蓝-靛玉红组分配伍低(5mg·kg-1)、中(20mg·kg-1)、高剂量(50mg·kg-1)对3％葡聚糖硫酸钠(Dextransulfatesodiumsalt,DSS)诱导的小鼠UC模型的治疗作用。体重变化结果表明，与模型组相比，各剂量组均能减轻小鼠体重降低,中剂量组对体重下降的缓解作用最佳，在第10天时体重变化率约为101％,与空白组接近。DAI评分结果表明，与模型组相比，各剂量组均能减轻模型组小鼠的DAI评分，中剂量组的效果最佳，DAI评分为0.75,降低为模型组的50％,空白组的2.2倍。结肠长度结果表明，与模型组相比，各给药组小鼠的结肠长度均增加，但仅中剂量组具有显著性差异（p＜0.01）,增加为模型组的1.3倍，接近空白组。结肠组织病理切片结果表明，与模型组相比，各剂量组炎症细胞浸润减少，肠黏膜上皮细胞完整性改善,中剂量组可清晰地观察到隐窝和杯状细胞结构,结肠组织损伤评分显著降低（p＜0.01）。 进一步通过体重变化、DAI评分、结肠长度及病理切片考察靛蓝-靛玉红组分配伍不同比例（0∶1、7.5∶1、15∶1、30∶1、1∶0）对3％DSS诱导的小鼠UC模型的治疗作用。体重变化结果表明，与模型组相比，各给药组均能减轻小鼠体重下降，靛蓝-靛玉红（7.5∶1）组对体重下降的缓解作用最显著（p＜0.01）,第9-10天体重变化率约为100％,与空白组接近。DAI评分结果表明，与模型组相比，各剂量组均能减轻模型组小鼠的DAI评分，第10天，靛蓝-靛玉红（7.5∶1）组的DAI评分降低约为模型组的2/5（p＜0.01）。结肠长度结果表明，与模型组相比，靛蓝-靛玉红（0∶1）组、靛蓝-靛玉红（7.5∶1）组、靛蓝-靛玉红（15∶1）组的小鼠结肠长度显著增加（p＜0.01）,其中靛蓝-靛玉红（7.5∶1）组的小鼠结肠长度最长，是模型组结肠长度的1.35倍，接近空白组结肠长度的80％。结肠组织病理切片结果表明，与模型组相比，各给药组炎症细胞浸润减少，肠黏膜上皮细胞完整性改善，病理评分显著性降低（p＜0.01）,其中靛蓝-靛玉红（7.5∶1）组的病理评分最低。综上所述，靛蓝-靛玉红组分配伍治疗UC的最佳剂量为20mg·kg-1,最佳比例为7.5∶1,该研究为靛蓝-靛玉红组分配伍治疗UC以及中药组分新药研究开发提供了科学依据。 2.靛蓝-靛玉红组分配伍对溃疡性结肠炎的机制研究 为深入解析靛蓝-靛玉红组分配伍对溃疡性结肠炎的作用机制，从肠黏膜屏障、抗炎、免疫调节和肠道菌群这几个方面系统对比靛蓝组、靛玉红组、靛蓝-靛玉红配伍组的作用特点。炎症因子结果表明，与模型组相比，给药组均可显著降低IL-17A、IL-23、IL-12、IFN-γ等炎症因子的表达(p＜0.01）,靛玉红组的效果最佳，其次是配伍组和靛蓝组。肠黏膜屏障方面，与模型组相比，靛蓝组、靛玉红组及配伍组均能显著增加E-cadherin、Occludin、Zonulaoccludens-1（ZO-1）和Mucin2（MUC2）的表达以及调节肠通透性（p＜0.01）,其中配伍组的效果最佳,其次是靛蓝组、靛玉红组。免疫调节方面，与模型组相比，靛蓝组、靛玉红组、配伍组均可有效调节巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、2型固有免疫淋巴样细胞(Group2innatelymphoidcell,ILC2)、3型固有免疫淋巴样细胞(Group3innatelymphoidcell,ILC3)的表达，其中配伍组在调节巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞等单核细胞的作用最佳，其次是靛蓝、靛玉红组;靛蓝对CD3-NK1.1+CD335+、ILC2的调控效果最佳，其次是配伍组和靛玉红组;靛玉红组对CD3-NK1.1+CD11b+、ILC3的调控效果最佳，其次是配伍组和靛蓝组。肠道菌群结果表明，与模型组相比，各给药组均可调节肠道菌群组成，增加有益菌群比例，降低有害菌群比例，其中配伍组效果最佳，其次为靛蓝组、靛玉红组。综上，靛蓝、靛玉红的作用优势分别在于免疫调节和抗炎，而配伍组的作用优势在于肠黏膜屏障和肠道菌群的调节，这可能由于组分配伍综合了靛玉红、靛蓝的抗炎和免疫调节优势，从而提高修复肠黏膜屏障和肠道菌群的作用，进而提高对UC的疗效。该研究为阐明青黛治疗UC从药材到组分配伍的科学内涵，揭示中药组分配伍的协同和整体性，促进中药现代化提供了研究基础。 3.靛蓝-靛玉红纳米晶体构建及评价 为提高靛蓝、靛玉红的溶解度，增强靛蓝-靛玉红的黏液穿透性能和免疫靶向性，选用靛蓝-靛玉红7.5∶1的最佳配伍比例，以Pluronic?F127(F127)和透明质酸(Hyaluronicacid,HA)修饰，采用高压均质法和喷雾干燥法制备靛蓝-靛玉红纳米晶体。以粒径、电位以及稳定性作为评价指标，考察F127和HA的不同比例(1∶2、2∶1、5∶1、1∶5、1∶1、1∶0、0∶1)对靛蓝-靛玉红纳米晶体的影响。结果表明，不同比例F127和HA所制备的纳米晶体粒径的D50均在193nm左右，Zeta电位均在-25mV～45mV之间。当F127与HA比例为2∶1时，纳米晶体的粒径较小且电位变化较小。因此，选择F127和HA的比例为2∶1制备靛蓝-靛玉红纳米晶体。通过再分散性(Redispersibilityindex,RDI)和得率筛选喷雾干燥保护剂的种类和用量，构建靛蓝-靛玉红纳米晶体固体粒子。以乳糖、共聚维酮、海藻酸钠、麦芽糊精、甘露醇、蔗糖、海藻糖作为喷干保护剂筛选种类，结果表明所有保护剂制备的纳米晶体固体粒子的RDI值均接近1,得率为:菊糖＞蔗糖＞麦芽糊精＞海藻糖＞甘露醇＞海藻酸钠＞乳糖＞共聚维酮，同时菊糖对UC具有治疗作用，因此选择菊糖作为纳米晶体的喷干保护剂。考察50％、100％、150％、200％、300％的菊糖对纳米晶体的影响，结果表明随着菊糖的用量增加，纳米晶体固体粒子的RDI和得率都呈增加的趋势，而当保护剂含量增加到100％时，再分散性和得率增加的趋势并不显著，并且考虑到载药量，因此选择100％作为喷干保护剂的用量。 采用扫描电镜、透射电镜对其纳米晶体的形态进行表征，扫描电镜表明纳米晶体固体粒子呈球形或类球形，中间凹陷，透射电镜发现喷干粉分散液为纳米级,分散性能良好，满足纳米晶体的要求。通过红外分析发现，纳米晶体固体粒子和原料药的吸收峰基本一致，制备过程中没有发生化学变化，分子间的作用力主要为氢键和范德华力。采用X射线衍射分析其晶体结构，纳米晶体、原料药和物理混合物均在10.63°、14.45°和26.22°处有三个衍射特征峰，说明高压均质和喷雾干燥过程并未改变靛蓝、靛玉红的晶体结构。进一步采用透析袋法考察体外释放度，与原料药相比，72h内靛蓝、靛玉红在纳米晶体中的累计释放度分别提高了近2.5倍和1.5倍，靛蓝、靛玉红的溶出速率可显著提高。综上，靛蓝-靛玉红纳米晶体具有粒径小、分散性能好、溶出速率较高等性质，改善了靛蓝-靛玉红溶解度较差的问题，对靛蓝-靛玉红临床治疗UC具有重要意义。 4.纳米晶体穿透性和细胞摄取性能评价 为考察靛蓝-靛玉红纳米晶体的黏液穿透性能和细胞摄取性能，将药物分为F127/HA(F127∶HA=2∶1)纳米晶体组、HA纳米晶体组、F127纳米晶体组、对照组，采用多粒子追踪、结肠黏液3D穿透、琼脂糖实验、体外黏液与药物的相互作用评价黏液穿透性能，采用激光共聚焦和流式细胞仪评价细胞的摄取性能。多粒子追踪结果表明，F127/HA组在黏液中横移距离最长，扩散面积最大，MSD值是对照组的5.23倍，表明F127/HA纳米晶体具备跨黏液快速扩散的能力。结肠黏液3D穿透实验结果表明，与对照组和HA组、F127组相比，F127/HA组在黏液中的穿透深度最大。琼脂糖实验结果表明F127/HA-组在4h可达到40％的黏液渗透率，分别约为对照组、HA组、F127组渗透率的24.3、2.2、3.2倍，具有较高的黏液渗透效率。体外黏液与药物的相互作用结果表明，与黏液混合后F127/HA组的粒径变化较小，且Zeta电位随着时间变化不大，表明F127/HA与黏蛋白的相互作用小。MTT实验结果表明靛蓝-靛玉红、F127和HA具有良好的细胞相容性。通过激光共聚焦以及流式细胞仪对巨噬细胞对药物的摄取进行定性和定量分析，结果表明细胞摄取F127/HA、HA和F127组的荧光强度均高于对照组，HA组、F127/HA组、F127组的荧光强度分别为对照组的2.9、2.6、2.0倍，进一步表明HA以及F127修饰可增强巨噬细胞对靛蓝-靛玉红的摄取。以DIR作为荧光模型制备纳米晶体，通过活体成像仪考察其在UC和健康小鼠的体内分布，对照组在健康小鼠和UC小鼠中的荧光强度相近，而在纳米晶体组给药后24h,UC小鼠的荧光强度是健康小鼠的1.8倍，表明纳米晶体组在UC小鼠中滞留时间更长。综上，靛蓝-靛玉红纳米晶体具有良好的黏液穿透性能、细胞摄取性能以及在UC小鼠体内的滞留能力，有助于提高对UC的疗效，为炎性肠病领域应用提供的新的思路和方法。 5.纳米晶体治疗UC的体内药效学评价 为验证将靛蓝-靛玉红制备F127/HA修饰的纳米晶体的体内药效，以体重变化率、DAI评分、结肠长度、病理切片、炎症因子、结肠固有层免疫细胞的表达作为评价指标，探究纳米晶体与原料药对UC的药效差异。结果表明，与模型组相比，给药组均可提高体重，降低DAI评分，增加结肠长度(p＜0.01),显著调节TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10的表达(p＜0.01),降低巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞的表达。其中，纳米晶体组治疗效果最佳，各项指标趋向正常，其体重可提高至模型组的1.2倍，DAI评分降低为模型组的60％,结肠长度增加至模型组的1.3倍，TNF-α、IL-6、IL-1β的表达分别降低为模型组的40％、30％、36％,IL-10的表达提高至模型组的1.5倍，巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞分别降低约为模型组的60％、50％和60％。以上结果表明，纳米晶体可提高靛蓝-靛玉红原料药对UC的治疗效果，其机制与免疫调节相关，为靛蓝-靛玉红的成药性提供了理论依据和技术支撑。 综上，本研究首次证实了靛蓝-靛玉红组分配伍可提高对UC的治疗效果，优选了靛蓝-靛玉红配伍的最佳剂量和比例，阐明了靛蓝-靛玉红配伍在肠黏膜屏障、肠道菌群及免疫调节治疗UC互补优势。此外，构建了靛蓝-靛玉红黏液穿透免疫靶向纳米晶体递药系统，改善了靛蓝-靛玉红溶解度差的问题，提高了黏液穿透性能、细胞摄取以及在UC小鼠体内的滞留能力，实现了对UC的疗效显著提高，对炎性肠病领域创新药物的开发和临床应用具有重要的参考意义。
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