摘要
高盐有机废水主要来源于化工、医药、食品和农药等相关行业。这类废水除了含有有机污染物外，还含有较高浓度的溶解性无机离子（Cl-，SO42-，Na+，Ca2+）。肝素钠生产废水属于典型的高盐有机废水，盐度通常在2.5%以上，且COD含量（以蛋白质源有机质为主）较高。厌氧生物法比较适用于高浓度有机废水的处理，但是在高盐环境下如何提高处理能力是关键。基于生物强化理念，通过构建耐盐生态菌群以提高处理效能是可行方案之一，但是目前相关研究报道较少。有鉴于此，本论文以模拟肝素钠废水为研究对象，首先通过“自上而下”的菌群驯化方法，获得了具有一定耐盐能力的厌氧菌群。针对高盐胁迫下蛋白质水解受抑问题，定向筛选耐盐蛋白酶产生菌，并考察其在不同盐度下的代谢特性。在此基础上，将耐盐蛋白酶产生菌与驯化菌群复配构建新生态菌群，有效提高了肝素钠生产废水的厌氧处理效能。论文主要研究结果如下： （1）基于“自上而下”的菌群驯化方法，通过梯度提升盐胁迫压力成功构建出能够耐受3.2%盐度的厌氧生态菌群。耐盐厌氧菌群在盐度3.2%的运行条件下，蛋白质平均降解率达到90.11%，COD平均去除率和沼气平均生产强度分别达到80.21%和318.68L/m3/d。当盐度由3.2%提升至3.6%时，COD去除率逐渐下降至52.50%-55.20%之间，出水蛋白质浓度增加了近1.08g/L，而VFAs浓度仅升高了0.49g/L左右，且蛋白酶活性由116.15U/mL显著降低至89.05U/mL。因此可以推断在3.6%的盐度下，相较于产甲烷途径，蛋白质水解阶段受抑更为显著，成为限速步骤。微生物高通量测序结果表明，相较于古菌种群，盐胁迫对细菌种群的影响更为显著。经过盐度梯度驯化，Unclassified_Bacteroidetes、unclassified_Clostridiales、unclassified_Porphyromonadaceae和Acetoanaerobium是细菌优势种群。Methanothrix、Methanomassiliicoccus和Methanobacterium是古菌优势种群。 （2）为解决高盐度胁迫下蛋白质水解受抑的问题，以耐受3.2%盐度的驯化菌群为菌种来源定向筛选高产蛋白酶的耐盐菌。首先在4.0%盐度的蛋白胨固态培养基上分离纯化得到16株菌株，然后通过透明圈和明胶液化实验初筛以及耐盐实验复筛后，最终得到三株能够耐受8.0%盐度的蛋白酶产生菌（A1、A2、A7）。经分子生物学鉴定，这三株菌的最大相似性菌株均为原玻璃蝇节杆菌（Arthrobactersp.），但是其序列并不完全相同。不同盐度下的摇瓶实验结果发现，随着盐度的升高，各菌株的生长性能和蛋白质降解率均有所降低。2.0%盐度下，A1、A2、A7的蛋白质降解率分别为45.41%、43.64%、41.45%；而当盐度升高至8.0%时，蛋白质降解率分别降低为26.04%、21.51%、20.40%。此外，各盐度条件下的蛋白酶活性和细菌生物量大致都在第二天达到峰值，说明三种菌株蛋白酶的产生与细胞生长相偶联。 （3）将耐盐蛋白酶产生菌与驯化菌群复配构建新生态菌群，有效提高了肝素钠生产废水的厌氧处理效能。3.6%盐度运行条件下，COD去除率由54.00%逐渐上升至76.50%；且进一步提高盐度至4.6%，稳态下的COD去除率仍能保持在70%以上。在盐度为3.6%-5.2%的胁迫范围内，蛋白质降解率均能达到90%以上。但是在5.2%盐度运行条件下，COD去除率显著下降至36.00%-39.60%，稳态下的VFAs浓度增加至在4.07-4.50g/L之间。由此可见，耐盐蛋白酶产生菌的引入能够有效解决高盐胁迫下的蛋白质水解受抑问题，但是产甲烷阶段却成为了限速步骤。分别以乙酸钠和H2/CO2为唯一碳源，进一步分析了盐度对生态菌群产甲烷途径的影响，结果表明盐度对乙酸型产甲烷途径抑制更为显著。耐盐蛋白酶产生菌的引入改变了反应器中细菌和古菌的优势种群结构。此外，盐度的增加会激发厌氧菌群分泌更多的结合型胞外多聚物（B-EPS）以保护细胞。
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