摘要
研究背景： 结直肠癌是世界第三大常见癌症，全球发病率和死亡率不断上升。结直肠癌免疫疗法虽然推动了肿瘤患者生存模式的转变，但它只对少数微卫星高度不稳定/错配修复缺陷（MSI-H/dMMR）的患者效果明显。越来越多的证据表明，肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associatedmacrophages,TAMs)作为肿瘤微环境(Tumormicroenvironment,TME)中丰富且活跃的浸润性炎症细胞，是肿瘤免疫抑制微环境中最重要的组成部分，具有促进肿瘤进展及转移的作用，对结直肠癌具有免疫治疗敏感性。在结直肠癌促瘤微环境中，炎性M2TAMs表型占肿瘤细胞质量的50%，而免疫保护性M1型TAMs表型则很少。M2型巨噬细胞通过调节细胞因子、趋化因子、蛋白酶、活性氧等促进肿瘤细胞增殖、诱导免疫抑制、与实体肿瘤预后不良有关。鉴于其重要作用，TAMs已成为癌症免疫治疗的有前途的靶点。目前以TAMs为靶点的治疗方法包括抑制TAMs的招募、干扰TAMs的存活，以及促进TAMs向M1型复极化。其中将TAMs复极化为M1型的免疫治疗策略不仅保留了巨噬细胞的固有免疫，而且改善肿瘤的免疫抑制微环境，是当前研究的热点及重点。所以，本研究的要点就是构建双模态超粒子平台，并对其进行修饰，以实现靶向TAMs，并使其复极化为M1型，以改变肿瘤免疫抑制微环境，从而增加抗肿瘤作用。为了达到这一目的，就需要量化TAMs在TME中的量以及分布。因此，实时跟踪TAMs在免疫治疗前、治疗中和治疗后的分布以及量，对提高结直肠癌患者的定制化免疫治疗疗效是非常必要的。基于以上目的，我们开发了碳点（CDs）/Fe3O4光磁双模态纳米粒子。 目前，纳米材料已被广泛应用于各个领域，其中CDs受到越来越多的关注。CDs是碳家族中最有前途的候选者，因其具有超小体积、高水溶性、低细胞毒性和固有的光致发光等优越性能，使其在生物医学领域得到广泛应用。以往关于炎症的报道表明碳点可以使M2型巨噬细胞复极化，这表明碳点可能是一种有前途的应用于TAMs的材料。所以开发具有高穿透力稳定近红外发光的碳点，在生物成像方面以及图像引导光热治疗方面至关重要。 SPIONs是FDA批准的用于磁共振成像的T2造影剂，已广泛应用于跟踪免疫细胞，如DC细胞和T细胞。以往的研究发现了它标记之外的功能，即氧化铁可以使M2型TAMs复极化为M1型，诱导芬顿反应，产生ROS，促进肿瘤细胞凋亡。氧化铁纳米颗粒具有超顺磁性和复极化等特性，在临床上具有广阔的应用前景。但是其主要缺点是不能区分死细胞和活细胞，MRI中的信号空洞不能定量体现细胞数量，并且体内细胞复制的同时标记也被稀释，所以这也是我们制备光磁双模态成像纳米平台的优势所在。 所示本研究中，我们开发了具有稳定近红外发光特性的碳点，利用碳点的近红外发光特性，结合氧化铁的磁共振T2阴性成像优势，构建CDs/Fe3O4双模态成像超粒子平台，利用M2型TAMs表面高表达的甘露糖受体对其进行靶向性成像，在实时定量无创示踪TAMs的同时，利用碳点及氧化铁的复极化特性，促进TAMs向M1型转化，同时增加T细胞浸润，在改变免疫微环境同时兼具抗肿瘤免疫治疗作用。 研究目的： 本课题旨在结合碳点和氧化铁的优势：1开发一种稳定的具有光磁双模态成像能力的CDs/Fe3O4超粒子平台并对其进行表征。2通过体内、外实验验证光磁双模态纳米粒子对TAMs的靶向性以及活体示踪能力。3通过体内、外实验验证光磁双模态纳米粒子具有通过诱导TAMs向M1型复极化，改善肿瘤免疫微环境、增强抗肿瘤作用。 研究方法： 1．光磁双模态纳米粒子的制备及其性能测定 本课题中，我们以IR-813对甲基苯磺酸盐及聚乙二醇（PEG400）为原料，用溶剂热法，采用自下而上方法制备了具有稳定近红外发光的CDs，然后用负载D-甘露糖的DSPE-PEG2000利用其亲疏水的超分子相互作用特性,对疏水性的CDs及Fe3O4进行包覆，合成具有良好稳定性及生物相容性的纳米粒子。然后对制备的DSPE-PEG-Man@Fe3O4-Cds纳米粒子进行表征，通过透射电镜检测其形貌，DSL检测其粒径及电位，利用分光光度计测量其荧光光谱，利用磁共振成像检测其T2阴性成像能力并利用T2mapping进行定量研究。通过CCK8实验及对小鼠内脏进行Hamp;E染色测定其生物安全性。 2．光磁双模态纳米粒子对TAMs的靶向性 首先检测纳米粒子对TAMs的体外靶向性。利用流式细胞术检测TAMs及M2型巨噬细胞标志性细胞因子，验证TAMs主要为M2型。用激光共聚焦显微镜及流式细胞仪检测分别在M2型巨噬细胞内加入靶向性、非靶向性纳米粒子，以及经过甘露糖封闭后，M2型巨噬细胞对纳米粒子的摄取情况。然后制备小鼠结直肠癌皮下移植瘤模型及肝转移瘤模型，尾静脉分别注射等量PBS、靶向性及非靶向性纳米粒子后，进行活体荧光成像及磁共振成像。 3．光磁双模态纳米粒子促进TAMs向M1型复极化 我们将纳米粒子与M2型巨噬细胞共培养，然后利用qRT-PCR实验以及WB实验从核酸到蛋白水平检测纳米粒子的复极化作用。用流式细胞仪检测与各种纳米粒子共孵育后，ROS水平的变化。然后制备小鼠结直肠癌皮下移植瘤模型，成瘤后对其进行分组治疗，然后利用免疫荧光方法及流式细胞术检测各组治疗后M1型及M2型TAMs量的变化。 4．光磁双模态纳米粒子改善肿瘤免疫微环境及抗肿瘤作用 首先将巨噬细胞与纳米粒子共培养，制备条件培养基，然后利用CCK8实验检测小鼠结直肠癌MC38细胞与不同种条件培养基共培养后细胞的活力。然后对荷瘤小鼠进行分组治疗，同时监测肿瘤生长情况，治疗2周后取肿瘤，用免疫荧光方法及Tunel染色方法检测肿瘤组织中效应T细胞的数量以及肿瘤细胞的凋亡情况。 研究结果： 1.光磁双模态纳米粒子的制备及其性能测定 研究结果表明，经过甘露糖靶向修饰，获得一种水分散性好、粒径均一、结构稳定的纳米生物材料。利用其优异的近红外发光特性，增强组织穿透能力，因其有显著的磁共振T2WI阴性成像特性，可提供良好的空间分辨率和组织对比度，并且利用T2mapping成像可以进行定量研究。体外细胞实验及小鼠体内实验验证了其生物安全性。 2.光磁双模态纳米粒子对TAMs的靶向性 体外激光共聚焦显微镜及流式细胞术显示，M2型巨噬细胞分别与靶向性、非靶向性纳米粒子共孵育，M2型巨噬细胞对靶向性纳米粒子的摄取能力最强，经甘露糖封闭后，其摄取能力明显减弱。制备小鼠结直肠癌皮下移植瘤模型及肝转移瘤模型，尾静脉注射不同组纳米粒子后，进行体外荧光成像及磁共振成像，结果显示，两种模型中靶向性纳米粒子主要被肿瘤组织摄取，且无论是荧光成像还是磁共振成像能力均优于非靶向性纳米粒子组，而后者成像能力优于PBS对照组。 3.光磁双模态纳米粒子促进TAMs向M1型复极化 体外细胞实验qRT-PCR结果表明：靶向性纳米颗粒具有与氧化铁相似的复极化效应，M1型标志物CD86、TNF-α和IL12明显升高，M2型标志物CD206、ARG1和VEGF明显降低。本实验中，我们特别的发现，靶向性碳点也具有促进M1型标志物CD86、TNF-α明显升高、M2型标志物CD206、ARG1和VEGF明显降低的作用。WB结果显示，与靶向性纳米粒子组共培养后，蛋白STAT1表达水平增高、STAT6、P-Erk表达水平降低。采用流式细胞术检测与不同组纳米粒子共孵育后ROS水平，结果显示，靶向性纳米粒子组ROS水平明显增高。荷瘤小鼠经治疗后，肿瘤免疫荧光分析显示，靶向性纳米粒子组M1型(CD86+)巨噬细胞量增加，M2型(CD206+)巨噬细胞量减少。流式细胞术结果显示，靶向性纳米粒子组M1（CD86+）型巨噬细胞量增加。 4.光磁双模态纳米粒子改善肿瘤免疫微环境及抗肿瘤作用 体外细胞实验结果表明，M1型条件培养基对MC38小鼠结直肠癌细胞有明显抑制作用，M2型条件培养基有明显促进作用。经靶向性纳米粒子诱导的条件培养基对MC38小鼠结直肠癌细胞有明显抑制作用，而非靶向性纳米粒子组的抑制作用不明显。体内实现结果表明，经尾静脉注射治疗后，荷瘤小鼠的肿瘤生长明显受到抑制，对肿瘤组织进行免疫荧光分析及Tunel分析，结果显示，肿瘤的效应T细胞（CD3+、CD8+）数量明显增加，肿瘤细胞的凋亡情况明显增强。 结论： 1本研究成功构建了光磁双模态成像的CDs/Fe3O4超粒子平台。 2本研究中合成的纳米粒子DSPE-PEG-Man@Fe3O4-Cds通过靶向肿瘤相关巨噬细胞作用、利用近红外光（NIR）-磁共振（MRI）双模态成像，可以实时定量无创评估TAMs。 3本研究中的纳米粒子DSPE-PEG-Man@Fe3O4-Cds通过改变肿瘤微环境中TAMs的极化谱，显著增强抗肿瘤免疫反应，并且可以招募效应T细胞，改善肿瘤免疫抑制微环境。
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