摘要
猪感染致泻性大肠杆菌（DiarrhoealEscherichiacoli，DEC）后会导致猪水肿病（ED）、初生仔猪腹泻（ND）和断奶仔猪腹泻（PWD），表现为局部或全身炎症症状、严重腹泻，甚至败血症。仔猪腹泻会导致仔猪大量死亡，造成重大经济损失。近年来该病发生趋向于急性型，而临床上药物防治效果却极为不佳。抗生素类药物的广泛使用，使猪源大肠杆菌耐药性增强，耐药种类增多，使大肠杆菌引起的仔猪腹泻的防治工作变得极为困难，严重制约生猪养殖业健康发展。当前大量研究表明，诸多中药及微生态制剂对大肠杆菌病有一定的治疗效果，利用微生物发酵中药具有提高有效成分含量、增强疗效、调节动物肠道菌群等优势。因此研制益生菌发酵中药是防治DEC导致的仔猪腹泻的有效途径之一。本项目在前人的总结和实践基础上，对微生态制剂联合中药的应用进行深度挖掘，开发安全、有效、经济、质量可控的防治猪DEC性腹泻的发酵中药制剂。本项目通过益生菌来发酵复方中药（止泻古方葛根芩连汤合理中汤加减而成），使用猪源的DEC来建立小鼠腹泻模型，探究发酵复方中药对猪源DEC所致小鼠腹泻的预防及治疗作用效果，为发酵中药防治DEC所致仔猪腹泻的临床应用提供科学数据支持。具体内容及结果如下： 1.首先对全球猪致病性大肠杆菌（ETEC、STEC）的流行率进行了Meta分析。在CNKI、ScienceDirect、WebofScience和PubMed4个数据库中检索到相关研究626篇，经筛选23篇纳入研究，提取相关风险因素信息后，采用Cochran-Q检验、I2检验和χ2检验计算研究的异质性，单变量回归分析来验证异质性的潜在来源和不同风险因素对猪大肠杆菌病流行率的影响。结果显示，全球猪大肠杆菌病的流行率为13.31%，且2016年后有增加的趋势，主要是由产肠毒素大肠杆菌（ETEC）引发。 2.对发酵用益生菌进行筛选。通过对3株乳酸菌、6株芽孢杆菌和6株酵母菌进行酸、胆盐、人工胃肠液的耐受性检测以及产纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶的产酶能力检测来筛选发酵用菌。结果显示，发酵乳杆菌RF1（产纤维素酶）、酿酒酵母N3（产淀粉酶）、枯草芽孢杆菌YK（产淀粉酶和蛋白酶）具有较强的产酶能力和耐受性；地衣芽孢杆菌YD虽然耐受能力较弱，但其产淀粉酶和蛋白酶的能力较强。因此选择RF1、N3、YK和YD作为发酵菌种。 3.对益生菌发酵复方中药的发酵条件进行摸索及优化。本研究选用的中药组方是根据治疗腹泻的核心方剂“葛根芩连汤”合“理中汤”加减而成。利用筛选出的益生菌对复方中药进行发酵，以综合发酵后的pH值、每克发酵复方中药的活菌数、每克发酵复方中药的黄酮含量和多糖含量的评分为评价标准，通过单因素试验对氮源添加量、碳源添加量、含水量、接菌量、发酵时间及发酵温度的6个发酵条件进行摸索，并通过正交试验对单因素试验得出的最佳含水量、最佳接菌量、最佳发酵时间和最佳发酵温度进一步优化，得出最佳发酵条件。结果显示，最佳发酵条件是在20%氮源添加量、3%接菌量、40%含水量及35℃条件下发酵2天。 4.考察发酵复方中药对猪源DEC所致小鼠腹泻的作用效果。通过给小鼠腹腔注射不同剂量的猪源DEC建立腹泻模型，设立空白组、模型组、氟苯尼考组、未发酵中药组（62.5mg/mL）、发酵复方中药的高剂量组（125mg/mL）、中剂量组（62.5mg/mL）、低剂量组（31.25mg/mL），探究不同剂量的发酵复方中药对猪源大肠杆菌所致小鼠腹泻的治疗与预防效果。结果显示，给小鼠注射200μL浓度为1.0×108CFU/mL的DEC后，攻毒小鼠出现明显的腹泻症状，腹泻率100%，死亡率20%，可以成功建立小鼠腹泻模型；高剂量的发酵复方中药给药3天后全部停止腹泻，且死亡率除空白组外最低（死亡1只）；高剂量的发酵复方中药治疗可以显著缓解大肠杆菌引起的小鼠肝脏和脾脏肿大，并且显著降低促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平，显著提高抗炎细胞因子IL-4和IL-10的水平。因此发酵复方中药对猪源大肠杆菌引发的腹泻具有良好的治疗效果，但预防效果微弱。 综上所述，本研究通过Meta分析统计了猪大肠杆菌病在全球的流行率为13.31%；建立并优化了益生菌发酵复方中药的固体发酵体系；成功构建猪源DEC所致腹泻小鼠腹泻模型，并发现发酵复方中药可以有效治疗大肠杆菌引起的小鼠腹泻，可以缓解小鼠大肠杆菌引起的肝脏和脾脏肿大，并通过降低促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α）水平和提高抗炎细胞因子（IL-4、IL-10）水平来控制小鼠炎症水平。
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