摘要
目的：帕金森病（ Parkinson’s disease, PD ）是一种常见的神经退行性疾病，寻找PD的治疗靶点和抗PD活性先导物具有重要意义。天然产物芒果苷具有抗氧化和抗炎等多种生物学活性，本研究旨在阐明芒果苷对 PD 的治疗作用以及探究其可能的分子机制，为芒果苷治疗PD提供理论依据。 方法： 1. 芒果苷体外对Rot诱导SH-SY5Y的细胞损伤保护作用 在体外抗鱼藤酮（Rotenone, Rot）诱导 SH-SY5Y 细胞损伤作用研究中，SH-SY5Y细胞加入不同浓度的芒果苷作用6 、12和24 h，3-(4，5-二甲基噻唑 -2)-2， 5-二 苯 基 四 氮 唑 溴 盐（ 3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT ）法检测芒果苷的细胞毒性作用，优选芒果苷的治疗浓度。SH-SY5Y细胞加入不同浓度Rot孵育6、12、24和48 h，来优选造模条件。在优选条件下，芒果苷作用 SH-SY5Y细胞后进行 Rot造模 6、12和 24 h， MTT法检测细胞活力，荧光探针检测 ROS水平，JC-1 染色法检测细胞膜电位水平，试剂盒检测细胞上清液GSH和SOD水平，细胞呼吸仪检测细胞呼吸能力。 2. 芒果苷体内对MPTP诱导的PD小鼠的治疗作用 在体内抗 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（ 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP ）诱导的PD小鼠作用研究中，4-6周龄的雄性C57小鼠60 只，将小鼠分为空白组、模型组、芒果苷给药剂量高中低三组。模型组小鼠腹腔注射MPTP （ 20 mg/kg ） 溶液，每天给药一次，连续注射7天，高中低剂量给药组小鼠在给予 MPTP同时给予芒果苷，造模结束后继续灌胃给药 1周。给药结束后对小鼠的行为学和步态进行分析；同时对脑组织黑质纹状体部位进行病理学相关染色，观察脑组织损伤程度以及GFAP和IBA-1蛋白的免疫荧光检测。 3.芒果苷治疗PD的分子机制研究 分子机制研究中，采用 Western blotting、免疫荧光等方法考察芒果苷对体内外 PD模型下靶蛋白 G蛋白偶联受体激酶 2 相互作用蛋白-1 （G-protein-coupled receptor interacting protein 1, GIT1）介导的氧化应激信号通路相关蛋白 p-ERK、Keap1、Nrf2、HO-1、SOD表达的影响，进一步应用SH-SY5Y细胞GIT1 siRNA转染实验，考察下调靶蛋白 GIT1 表达后的芒果苷对细胞活力、氧化应激相关SOD 和 GSH 水平以及氧化应激相关蛋白 GIT1、p-ERK、Keap1、Nrf2、HO-1、SOD蛋白表达水平的影响。 结果： 1.体外实验结果显示，当芒果苷浓度低于200 nM 时，对SH-SY5Y细胞存活率无显著影响；而当芒果苷浓度到200nM作用24h时，SH-SY5Y细胞出现活力降低，说明芒果苷对细胞开始产生毒性。因此，选择芒果苷浓度在1-200 nM范围内进行后续实验。同时选择Rot浓度为1 μM作用24 h建立PD体外模型；与模型组相比，芒果苷高中低三个剂量给药 12 h后，对损伤的 SH-SY5Y细胞具有保护作用，并降低 α-syn 表达水平，ROS 水平和线粒体膜电位也显著降低；芒果苷可显著上调GSH和SOD的表达水平，降低细胞呼吸水平和耗氧量。 2.在体内实验结果中，与模型组相比，芒果苷能显著改善PD小鼠旷场实验中的活动行为能力，同时步态分析结果显示芒果苷能显著增加小鼠步幅长度和摆动速度，并且能显著减少小鼠的支撑时间、速度变化率和步幅周期等步态分析指标，说明芒果苷能显著改善PD小鼠的步态紊乱。小鼠脑组织黑质纹状体HE染色结果显示，芒果苷能减少炎症细胞浸润和组织坏死，改善脑组织病理结构，下调脑组织中 GFAP和 IBA-1的蛋白表达水平，且能抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的活化。 3.芒果苷治疗PD作用机制研究表明，与模型组相比，芒果苷显著上调PD模型体内外靶蛋白GIT1和p-ERK的表达水平，同时增加Nrf2、HO-1、SOD蛋白表达水平，抑制Keap1蛋白表达水平；利用GIT1 siRNA低表达GIT1，实验结果显示，与Rot组相比，低表达GIT1可以抑制芒果苷对SH-SY5Y细胞的保护作用。同时，在应用GIT1 siRNA的作用下，细胞内ROS、线粒体膜电位、SOD和GSH的表达水平重新升高，且p-ERK、Keap1、Nrf2、SOD和HO-1蛋白的表达水平降低。这些结果表明，芒果苷可以通过激活 GIT1进而调控氧化应激通路，来对 PD起到治疗作用。 结论： 芒果苷具有较好的治疗PD的效果。在体外水平，对Rot诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有良好的保护作用；在体内水平，能够改善 MPTP 诱导的小鼠行为学和步态紊乱，降低体内外氧化应激水平。芒果苷治疗PD的作用是通过上调GIT1和p-ERK表达，进而调控Keap1/Nrf2氧化应激信号通路来实现的。总之，芒果苷在抗PD方面具有较大的研究和开发价值。
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