摘要
全球变暖背景之下，夏季持续高温严重影响我国畜牧业的健康发展。研究表明热应激导致的畜禽死亡率升高、生长和繁殖性能下降造成了严重的经济损失。近年来大量研究通过选育高性能耐热品种、研发营养或非营养添加剂、调整饲养模式等方式，应对热应激对养殖业造成的冲击。禽类的繁殖性能与卵泡的发育状况以及激素分泌水平密切相关，颗粒细胞在其中发挥重要作用。在热应激条件下，高温可直接或间接引起ROS生成增加，导致线粒体损伤和功能障碍，进而影响能量代谢。线粒体在能量代谢中发挥重要作用，是类固醇激素生物合成的中心部位。前期研究中发现，热处理诱导颗粒细胞线粒体自噬，但对类固醇激素合成的影响及其调控机制尚不清楚。AMPK作为线粒体生理学和细胞能量代谢的调节核心，可参与线粒体质量控制以维持线粒体稳态。研究推测颗粒细胞可通过AMPK调节细胞功能以应对热处理造成的损伤。为此，本研究借助蛋鸭动物模型和体外培养的颗粒细胞平台，围绕线粒体开展热应激导致蛋鸭繁殖性能下降的分子机制研究，探索热处理对颗粒细胞能量代谢和线粒体功能的影响，揭示AMPK对颗粒细胞线粒体自噬以及类固醇合成的调控机制。 本研究首先对比了热应激卵巢组织和热处理体外培养颗粒细胞的糖酵解和三羧酸循环相关酶转录和蛋白表达的变化。结果表明，热应激会导致鸭卵巢组织三羧酸循环和糖酵解关键酶蛋白表达量显著下降，但在体外培养的颗粒细胞中，热处理显著上调了三羧酸循环和糖酵解关键酶的蛋白表达量。进一步在体外培养的颗粒细胞上探究热处理对线粒体功能的影响，结果发现颗粒细胞在经过热处理后，ATP水平、ATP合成酶和线粒体呼吸链复合物Ⅰ-Ⅴ的活性发生不同程度的降低，线粒体活性氧的含量增加，线粒体DNA拷贝数下降。值得注意的是，卵巢组织和体外培养颗粒细胞中AMPK和ULK1的磷酸化水平在经热处理后均显著增加，AMPK/ULK1信号通路经热处理后被激活。此外，在经过热处理后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1和Parkin的表达明显升高，P62和Tom20的表达水平下降，共同表明热处理可以显著提高细胞的自噬水平，诱导细胞发生线粒体自噬。 随后使用AMPK激活剂AICAR以及AMPK抑制剂CompoundC分别激活和抑制AMPK,研究AMPK对颗粒细胞线粒体自噬以及类固醇合成的影响。结果显示，激活AMPK可以显著提高LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1和Parkin的表达，降低Tom20、P62的蛋白表达水平，从而诱导颗粒细胞发生线粒体自噬。此外，激活AMPK显著上调了基础条件和热处理条件下颗粒细胞类固醇合成酶CYP11A1、CYP19A1、3βHSD的蛋白表达水平。使用CompoundC抑制AMPK可显著降低PINK1、Parkin和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达，增加P62和Tom20的蛋白表达水平，有效抑制热处理条件下的线粒体自噬。并且抑制AMPK会导致类固醇合成酶蛋白表达水平降低。后续进一步利用si-RNA干扰AMPK和ULK1进行验证，结果显示RNA干扰AMPK和ULK1的蛋白表达水平，可显著减少线粒体自噬的发生。并且干扰AMPK及ULK1均显著下调了类固醇合成酶的蛋白表达量，降低了培养液中雌二醇的水平。 综上所述，热处理导致鸭颗粒细胞能量代谢紊乱、线粒体损伤和功能障碍、AMPK/ULK1信号通路被激活。同时热处理条件下线粒体自噬水平显著提高，类固醇合成酶蛋白表达量下降。进一步的研究表明，AMPK/ULK1途径参与热处理诱导的线粒体自噬，并通过调控类固醇合成酶的蛋白表达量影响相关激素分泌。
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