摘要
目的： 伤寒沙门菌（SalmonellaentericaserovarTyphi,S.Typhi）感染仍旧是全球性的公共卫生问题，其致病机制的完善研究对于治疗感染至关重要，S.Typhi的VI型分泌系统（T6SS）具备直接将细菌效应蛋白传递至真核宿主或细胞外环境的能力，被认为是细菌生存和致病过程中的重要毒力因子。本课题前期利用蛋白组学技术比较S.Typhi野生菌株（WT）和T6SS缺陷株（ΔsciG）在T6SS表达条件下的分泌蛋白水平，提示多个鞭毛相关蛋白的分泌量发生明显变化。鞭毛作为细菌运动的主要结构装置，参与细菌的黏附、定植与侵袭，同样与细菌的生存能力、致病机制息息相关，而T6SS与鞭毛分泌之间的相互关系尚未可知，本论文主要围绕S.TyphiT6SS对鞭毛蛋白分泌的影响及其机制展开探索，对于丰富T6SS的功能、T6SS与鞭毛系统的交互作用等具有重要意义。 方法： 1.T6SS对鞭毛蛋白合成和分泌的影响 （1）构建携带Flag蛋白标签的鞭毛序列重组载体，分别导入S.Typhi，同时构建对照菌株。 （2）收集T6SS表达条件下，培养12h的WT与ΔsciG的RNA，利用qRT-PCR检测鞭毛相关基因转录水平。 （3）收集T6SS表达条件下，培养12h的WT、ΔsciG与C-ΔsciG的分泌蛋白与菌体蛋白，利用westernblot检测鞭毛相关蛋白FliC、FlgD、FlgE、FliD含量。 （4）收集T6SS表达条件下，培养12h的WT、ΔsciG与C-ΔsciG菌液，注入0.3%LPM半固体培养基，并滴种于0.6%LPM半固体培养基表面，37℃孵箱培养，观察比较各菌株形成的动力圈大小。 2.T6SS是否参与鞭毛蛋白的分泌 （1）S.Typhi鞭毛缺陷株的筛选：在常规培养条件下通过qRT-PCR、westernblot以及动力实验，筛选鞭毛系统中参与分泌的基因，通过该基因（motA）的缺失关闭一部分鞭毛系统自主的鞭毛蛋白分泌功能。 （2）利用重组质粒构建S.Typhi双缺陷菌株ΔmotAΔsciG。 （3）收集T6SS表达条件下，培养12h的WT、ΔmotA、ΔsciG与ΔmotAΔsciG的RNA，利用qRT-PCR检测鞭毛基因转录水平。 （4）收集T6SS表达条件下，培养12h的WT、ΔmotA、ΔsciG与ΔmotAΔsciG的分泌蛋白与菌体蛋白，利用westernblot检测鞭毛蛋白FliC含量。 （5）收集T6SS表达条件下，培养12h的WT、ΔmotA、ΔsciG与ΔmotAΔsciG的菌株菌液注入0.3%LPM半固体培养基，并滴种于0.6%LPM半固体培养基表面，37℃孵箱培养，观察比较各菌株形成的动力圈大小。 （6）收集T6SS表达条件下，培养12h的WT、ΔmotA、ΔsciG与ΔmotAΔsciG的菌株做透射电镜，观察细菌鞭毛结构，如鞭毛数量、长度与位置。 3.T6SSSciG能否替代鞭毛系统ATPase的功能 （1）利用重组质粒构建S.Typhi鞭毛ATPase缺陷菌株ΔfliI。 （2）构建sciG+pBAD/Myc-HisA重组载体，电转导入ΔfliI得到表达SciG的菌株及其对照菌株。 （3）收集T6SS表达条件下，培养12h的WT+pBAD/Myc-HisA、ΔfliI+pBAD/Myc-HisA与ΔfliI+sciG+pBAD/Myc-HisA的RNA，用qRT-PCR检测鞭毛基因表达水平。 （4）收集T6SS表达条件下，培养12h的WT+pBAD/Myc-HisA、ΔfliI+pBAD/Myc-HisA与ΔfliI+sciG+pBAD/Myc-HisA的分泌蛋白与菌体蛋白，用westernblot检测鞭毛蛋白FliC含量。 （5）收集T6SS表达条件下，培养12h的WT+pBAD/Myc-HisA、ΔfliI+pBAD/Myc-HisA与ΔfliI+sciG+pBAD/Myc-HisA的菌株菌液注入0.3%LPM半固体培养基，并滴种于0.6%LPM半固体培养基表面，37℃孵箱培养，观察比较各菌株形成的动力圈大小。 （6）收集T6SS表达条件下，培养12h的WT+pBAD/Myc-HisA、ΔfliI+pBAD/Myc-HisA与ΔfliI+sciG+pBAD/Myc-HisA的菌株做透射电镜，观察细菌鞭毛结构，如鞭毛数量、长度与位置等。 结果： 1.T6SS对鞭毛蛋白合成和分泌的影响 （1）成功构建flgD::Flag、flgE::Flag、fliD::Flag重组载体，导入S.Typhi，同时电转获得其对照菌株:flgD::Flag+WT+pBAD33、flgD::Flag+ΔsciG+pBAD33、flgD::Flag+C-ΔsciG、flgE::Flag+WT+pBAD33、flgE::Flag+ΔsciG+pBAD33、flgE::Flag+C-ΔsciG、fliD::Flag+WT+pBAD33、fliD::Flag+ΔsciG+pBAD33、fliD::Flag+C-ΔsciG。 （2）qRT-PCR结果表示，T6SS表达条件下，与WT相比，ΔsciG上调了flhD、fliA的转录表达水平，同时下调flgD、flgE以及fliD的转录表达水平，对于fljB、fliC表达量的影响无明显差异。 （3）westernblot分析，T6SS表达条件下，与WT相比，ΔsciG菌体鞭毛蛋白表达水平没有明显差异，而上清液中鞭毛相关蛋白FliC、FlgD、FlgE、FliD的分泌量明显减少。 （4）动力实验中，T6SS表达条件下，与WT相比，ΔsciG动力圈半径较小，细菌动力水平减弱。 2.T6SS参与鞭毛蛋白的分泌 （1）S.Typhi鞭毛缺陷株的筛选：在常规培养条件下，与WT相比，ΔmotA下调鞭毛flhD、fliA转录水平，上调fliC、fliD转录水平，对flgG、fljB表达量的影响无明显差异；westernblot结果显示，与WT相比，ΔmotA菌体蛋白中FliC含量无明显差别，而上清液中鞭毛蛋白FliC分泌量减少；动力实验结果显示，与WT相比，ΔmotA动力减弱。综上，motA缺失能够关闭一部分鞭毛系统自主的鞭毛蛋白分泌。 （2）成功构建S.Typhi双缺陷菌株ΔmotAΔsciG。 （3）qRT-PCR结果表示，T6SS表达条件下，与WT相比，ΔmotA下调了flhD、fliA、flgG、fljB和fliC的转录表达水平，同时上调flgD、flgE和fliD的转录表达水平，对于fliK表达量影响无明显差异；与WT相比，ΔmotAΔsciG上调了flgD、flgE、fliA、fliK以及fliD的转录水平，同时下调flgG以及fljB、fliC的转录水平，对于flhD表达量的影响无明显差异。 （4）westernblot分析，T6SS表达条件下，与WT相比，ΔmotA、ΔsciG与ΔmotAΔsciG菌体鞭毛蛋白水平没有明显差异；而ΔmotA、ΔsciG上清液中鞭毛蛋白的分泌量明显减少，且与ΔmotA和ΔsciG相比，双缺陷株菌ΔmotAΔsciG上清液中鞭毛蛋白的分泌量进一步减少。 （5）动力结果显示，T6SS表达条件下，与WT相比，ΔsciG、ΔmotA与ΔmotAΔsciG动力明显减弱。 （6）透射电镜结果显示，T6SS表达条件下，与WT相比，ΔsciG、ΔmotA与ΔmotAΔsciG鞭毛数量明显减少。 3.T6SSSciG替代鞭毛系统ATPase的部分功能 （1）成功构建ΔfliI。 （2）成功构建sciG+pBAD/Myc-HisA重组载体，ΔfliI+sciG+pBAD/Myc-HisA及其对照菌株：WT+pBAD/Myc-HisA、ΔfliI+pBAD/Myc-HisA。 （3）qRT-PCR结果表示，在T6SS表达条件下，与WT+pBAD/Myc-HisA相比，ΔfliI+pBAD/Myc-HisA下调了flhD、fliA、flgD、fljB、fliC和fliD的表达量，对于fliK表达量的影响无明显差异；与ΔfliI+pBAD/Myc-HisA相比，ΔfliI+sciG+pBAD/Myc-HisA上调了flgD、fliA以及fljB的表达量，同时下调fliK以及fliD的表达量，对于flhD以及fliC表达量的影响均无明显差异。 （4）westernblot分析，T6SS表达条件下，与WT+pBAD/Myc-HisA相比，ΔfliI+pBAD/Myc-HisA和ΔfliI+sciG+pBAD/Myc-HisA菌体鞭毛蛋白FliC表达水平无明显差异，而上清液中鞭毛蛋白FliC的分泌量明显减少；与ΔfliI+pBAD/Myc-HisA相比，ΔfliI+sciG+pBAD/Myc-HisA上清液中鞭毛蛋白FliC的分泌水平上调。 （5）动力结果显示，T6SS表达条件下，与WT+pBAD/Myc-HisA相比，ΔfliI+pBAD/Myc-HisA和ΔfliI+sciG+pBAD/Myc-HisA动力均减弱，且后两者之间动力圈半径无明显差异。 （6）透射电镜结果显示，T6SS表达条件下，与WT+pBAD/Myc-HisA相比，ΔfliI+pBAD/Myc-HisA和ΔfliI+sciG+pBAD/Myc-HisA细菌鞭毛数量均减少。 结论： 1.在T6SS表达条件下，与WT相比，ΔsciG上清液中鞭毛蛋白FlgD、FlgE、FliD及FliC分泌量下降，与蛋白组学结果一致，且菌体蛋白无明显差别，因此T6SS主要影响鞭毛蛋白的分泌。 2.在T6SS表达情况下，T6SS参与鞭毛相关蛋白的分泌，影响S.Typhi动力水平及鞭毛结构完整性。 3.S.TyphiT6SS的SciG可部分替代鞭毛系统ATPaseFliI发挥功能，帮助鞭毛蛋白分泌至胞外。
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