摘要
细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)是指细菌生长过程中向胞外空间分泌的具有膜结构的纳米级小囊泡的统称，可以在细胞内外传递信息，影响目标细胞的生理和病理过程。益生菌能改善与肠道相关的炎症性疾病的症状，调节肠道菌群平衡，同时还能增强免疫系统的功能。随着EVs的研究不断深入，一些益生菌EVs的研究受到广泛关注。本试验分离纯化屎肠球菌的细胞外囊泡(EF-EVs),以IPEC-J2细胞、仔猪粪便、乙醇诱导的急性肠道损伤大鼠为模型,研究EF-EVs对肠道健康的影响。主要实验结果如下: (1)超速离心法从屎肠球菌培养液中分离纯化得到EF-EVs,透射电子显微镜(TEM)结果:囊泡呈不规则圆形，大小各异，部分聚集成团，纳米颗粒粒径分析(NTA)结果:囊泡直径大小平均约94.34 nm,范围在20-200 nm之间的囊泡占50.2％。EVs示踪试验:灌胃DiR标记的EVs,显示EVs在消化道富集。 (2)以IPEC-J2细胞为模型研究EF-EVs对细胞的作用。MTT结果显示:不同浓度 EF-EVs(0.001、0.01、0.1、1 μg EV protein/mL)与 IPEC-J2 细胞活力成正相关;研究EF-EVs(1 μg EV protein/mL)对IPEC-J2细胞增殖(CCND1、β-catenin、c-Myc)、细胞坏死(CASP、TNF、NF-kB、TGFβ)、细胞凋亡(BAX、BCL2、P53)、细胞自噬(BECN1、ATG16L1)、细胞通透性(TJP1、TJP2、CLDN2、OCLN)相关基因mRNA相对表达量，及细胞抗氧化能力(T-AOC、SOD、GSH-Px、LDH)的影响。与对照组相比添加EF-EVs使CCND1、BECN1 基因 mRNA 表达显著增加，BCL2、BAX、BCL2/BAX、CASP8、ATG16L1,TJP2、CLDN2、OCLN 基因 mRNA 表达极显著增加;与对照组相比EF-EVs的GSH-Px含量显著增加，LDH含量极显著降低。 (3)以断奶仔猪粪便培养物为模型研究EF-EVs对仔猪肠道菌群的作用。结果显示:EF-EVs(1 μg EV protein/mL)对仔猪粪便微生物丰度没有显著影响,组间差异物种的 LEfSe分析得到 EF-EVs处理组中挑剔真杆菌(Eubacterium_eligens_group)、毛螺菌目(Lachnospirales)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、梭状芽孢杆菌(Clostridia)相对丰度增加，其中EF-EVs处理组中挑剔真杆菌比对照组提高67.9％,EF-EVs组粪便培养物中乙酸、丁酸含量显著上升，戊酸含量显著下降。 (4)以乙醇诱导急性肠道损伤大鼠为模型研究EF-EVs对动物肠道健康的影响。乙醇造模组十二指肠肠道绒毛因为乙醇损伤融断严重，隐窝肿胀，EF-EVs 组肠道绒毛与隐窝轮廓清晰、结构完整，没有肿胀破损。与PBS组相比，乙醇造模组十二指肠绒毛长度降低30.1 ％,差异极显著，绒隐比显著下降;EF-EVs组与乙醇造模组相比绒毛长度增加46.8 ％,差异极显著，绒隐比升高差异显著。 综上所述超速离心法可以分离屎肠球菌中的囊泡，1μg EV protein/mL EF-EVs 的添加能够促进IPEC-J2细胞增殖、对抗细胞凋亡、减轻炎症、减少细胞坏死、保护细胞屏障、增强抗氧化能力;在一定程度上能够抑制病原菌滋生，影响代谢产物，保护肠道屏障;EF-EVs对乙醇诱导急性肠道损伤有优秀的预防作用。
NETL