摘要
目的：通过对H9c2细胞进行硫酸镍（NiSO4）染毒处理，观察NiSO4暴露导致的细胞焦亡，并探讨ROS/NLRP3/caspase-1信号通路在细胞焦亡发生过程中的作用及其与细胞凋亡之间的关系。 方法：（1）选择7~20代生长状况良好的H9c2细胞，采用不同浓度的NiSO4（0、62.5、250、1000μmol/L）处理24小时；分别用活性氧（ROS）抑制剂N-乙酰半胱氨酸（1000μmol/LNAC）预处理H9c2细胞1小时、caspase-1抑制剂Z-YVAD-氟甲基酮（20μmol/LZ-YVAD-FMK,YVAD）预处理H9c2细胞4小时，随后联合1000μmol/LNiSO4处理H9c2细胞24小时。 （2）采用CCK-8试剂盒检测在NiSO4诱导下H9c2心肌细胞的活性变化。 （3）采用生化检测试剂盒测定胞内活性氧（ROS）水平、乳酸脱氢酶（LDH）含量的变化。 （4）实时荧光定量法（RT-qPCR）检测H9c2细胞内焦亡相关因子（ASC、NLRP3、GSDMD、caspase-1、IL-18和IL-1β）和凋亡相关因子（P53、CytC、caspase-9、Bcl-2、Bak-1、Bax和caspase-3）的mRNA表达水平。 （5）蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测细胞焦亡相关蛋白（NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD、GSDMD-N、IL-18和IL-1β）和细胞凋亡相关蛋白（P53、Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9和cleaved-caspase-3）表达水平变化； （6）AnnexinV-FITC/PI试剂盒检测H9c2细胞总凋亡率的变化。 结果：（1）CCK-8检测NiSO4诱导H9c2细胞活性变化结果显示：采用不同剂量NiSO4（0、37.5、75、150、300、600、1200μmol/L）染毒H9c2细胞24小时后，结果表明75~1200μmol/LNiSO4组H9c2细胞存活率明显下降（Plt;0.05），且24小时的IC50为857.7μmol/L。 （2）根据毒性实验和IC50，最终选择62.5、250和1000μmol/LNiSO4染毒24小时，观察NiSO4对细胞焦亡的影响。①生化实验结果表明：与对照组相比，NiSO4染毒组细胞内ROS荧光强度明显增强，其中250、1000μmol/LNiSO4组荧光强度差异有统计学意义（Plt;0.05）；与对照组相比，NiSO4处理组细胞上清液中LDH的含量呈现剂量依赖性改变（Plt;0.05）。②RT-qPCR结果证实：与对照组相比，NiSO4处理可显著的增加H9c2细胞内ASC、NLRP3、GSDMD、caspase-1、IL-18和IL-1βmRNA的表达水平（Plt;0.05）；③Westernblot结果显示：与对照组相比，NiSO4处理可明显增加H9c2细胞内NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD、GSDMD-N、IL-18和IL-1β的蛋白水平（Plt;0.05）。 （3）为探讨ROS/NLRP3/caspase-1通路在NiSO4致H9c2细胞焦亡中的作用，选择NAC预处理H9c2细胞进行实验。①生化实验结果显示：与1000μmol/LNiSO4组相比，NAC+NiSO4组细胞内ROS荧光强度和上清液中LDH含量显著降低（Plt;0.05）。②RT-qPCR结果表明：与NiSO4组相比，NAC+NiSO4处理组H9c2细胞内ASC、NLRP3、GSDMD、caspase-1、IL-18和IL-1βmRNA的表达水平显著下调（Plt;0.05）；③Westernblot结果显示：与NiSO4组相比，NAC+NiSO4处理组细胞内NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD、GSDMD-N、IL-18和IL-1β的蛋白表达水平明显下降（Plt;0.05），说明NAC可缓解NiSO4诱导的H9c2心肌细胞的焦亡。 （4）为进一步探讨NiSO4诱导H9c2细胞损伤中细胞焦亡和凋亡的关系，选择YVAD处理H9c2细胞进行实验。①生化实验结果显示：与1000μmol/LNiSO4组相比，YVAD+NiSO4组细胞内LDH的含量显著降低（Plt;0.05）；②RT-qPCR结果表明：与NiSO4组相比，YVAD+NiSO4处理组H9c2细胞内GSDMD、caspase-1、IL-18和IL-1βmRNA的表达水平明显下调（Plt;0.05）；③Westernblot结果显示：相较于NiSO4组，YVAD+NiSO4处理组H9c2细胞内GSDMD、GSDMD-N、caspase-1、IL-18和IL-1β的蛋白水平显著下降（Plt;0.05）。说明YVAD能显著抑制caspase-1的表达并减缓NiSO4诱导的H9c2细胞焦亡的发生。④细胞流式结果显示：与对照组相比，1000μmol/LNiSO4处理组细胞总凋亡率与对照组相比明显增加（Plt;0.05）；与NiSO4组相比，YVAD+NiSO4组细胞凋亡率显著降低（Plt;0.05）。⑤RT-qPCR结果表明：YVAD+NiSO4组细胞内P53、CytC、caspase-9、Bak-1、Bax和caspase-3的mRNA水平较NiSO4组而言显著下调，而YVAD+NiSO4组仅Bcl-2mRNA表达水平被上调（Plt;0.05）；⑥Westernblot结果显示：YVAD+NiSO4组细胞内P53、Bax、caspase-3、caspase-9和cleaved-caspase-3的蛋白表达较NiSO4组而言被显著抑制，而YVAD+NiSO4组仅Bcl-2蛋白表达明显升高（Plt;0.05）。说明YVAD能显著减缓NiSO4诱导的H9c2细胞凋亡的发生。 结论：NiSO4可通过ROS/NLRP3/caspase-1信号通路诱导H9c2细胞发生焦亡，拮抗caspase-1依赖的焦亡可减轻NiSO4诱导的细胞凋亡。
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