摘要
目的: 运用Box-Behnken响应面法和正交设计法分别优化姜黄萜烯缀合姜黄素类化合物(terpene-conjugated curcuminoids,TCC)的超声提取和分离纯化工艺，考察TCC对大鼠酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)模型的保护作用，并基于 Toll 样受体 4(Toll-like receptor 4,TLR4)/髓样分化因子 88(myeloid differ-entiation factor 88,MyD88)/核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路对其作用机制进行初步探讨，为姜黄TCC有效部位的开发与应用奠定基础。 方法: (1)采用超声法提取姜黄药材的TCC有效部位，基于单因素试验结果，将甲醇浓度、液料比和提取次数作为考察因素，运用CRITIC权重法对提取物浸膏中总姜黄素含量、Bisabolocurcumin ether(BCE)含量和BCE得率进行综合评分,通过Box-Behnken设计优化实验，以综合评分为响应值，优化姜黄TCC的超声提取工艺。 (2)采用萃取法和色谱法对姜黄TCC进行分离纯化，依次用石油醚、乙酸乙酯对姜黄甲醇提取物进行萃取，得到的乙酸乙酯部位为本课题的研究对象;为得到更高纯度的姜黄TCC,本试验采用小孔树脂MCI分离纯化TCC,基于单因素试验结果，选择甲醇体积分数、洗脱流速和洗脱剂用量作为考察因素，运用正交实验设计，以纯化后TCC浸膏的总姜黄素含量、BCE含量和BCE回收率作为评价指标，优选最佳姜黄TCC的纯化工艺条件。 (3)56只SD大鼠分设对照组、模型组、美他多辛组、TCC(40、80、160 mg/kg/d)干预组和空白溶剂组，采用Lieber-DeCarli酒精液体饲料建立大鼠ALD模型，同时进行干预治疗;治疗8周，取血后处死大鼠并取肝脏，观察肝组织病理变化，测定大鼠肝指数、血清转氨酶、血脂代谢水平和肝组织氧化应激指标,ELISA法测定肝组织炎症细胞因子，Western Blot法(WB)和RT-PCR法分别检测TLR4,MyD88、NF-κB蛋白和mRNA的表达水平。 结果: (1)本试验通过优化姜黄TCC超声提取工艺，确定最佳提取条件为:甲醇浓度96％、液料比17 ∶ 1、提取次数2次、提取温度55℃、提取时间50 min;该条件下，浸膏得率为25.15％,醇提物浸膏总姜黄素和BCE含量分别为271.332 mg/g、7.678 mg/g,BCE 得率 0.202％,综合评分 73.5,与 Box-Behnken 响应面模型预测值74.1接近，拟合度佳。 (2)萃取处理得到的姜黄粗提物中总姜黄素和BCE含量分别为508.074 mg/g、12.956 mg/g,采用MCI完成对姜黄TCC的进一步分离纯化，确定最佳纯化条件为:上样量5 g,85％甲醇以流速30 mL/min洗脱3900 mL除杂，最后用丙酮洗脱至MCI柱无黄色，丙酮洗脱液经浓缩干燥得到姜黄TCC浸膏;该条件下，TCC浸膏中总姜黄素含量27.713 mg/g,BCE含量89.086 mg/g,BCE回收率95.239％,相较于姜黄粗提物，总姜黄素含量降低了 94.55％,总姜黄素去除率为98.86％,BCE含量提高了 5.87倍。 (3)肝组织病理学结果发现TCC可缓解酒精诱导的肝组织损伤;TCC低、中、高剂量组均可显著降低ALD模型大鼠的肝指数;与模型组相比，TCC各剂量组均能显著降低血清天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase,AST)活力，TCC中、高剂量组可显著降低血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)活力和总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)含量;相较于模型组，不同剂量TCC均能显著减少肝组织丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)含量，中、高剂量TCC可显著降低超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力，而高剂量TCC可显著降低谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)含量;TCC中、高剂量组均可显著降低ALD模型大鼠的肝组织肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)含量;WB和RT-PCR检测表明，TCC中、高剂量组能够显著抑制TLR4、MyD88和NF-κB蛋白和mRNA的相对表达。 结论: 本研究以姜黄为研究对象，采用响应面法结合CRITIC权重法，优化得到最佳的TCC超声提取工艺，该工艺稳定可靠、重现性好，适用于姜黄TCC的提取;以姜黄甲醇提取物浸膏为研究对象，运用正交设计法考察得到TCC最佳纯化工艺，该工艺稳定可控、损耗量低，适用于姜黄TCC的富集纯化;TCC对ALD模型大鼠具有一定的保护作用，改善肝组织损伤、血脂代谢紊乱和氧化应激，其作用机制可能与下调肝组织TLR4、MyD88、NF-κB的表达，抑制TNF-α、IL-6的合成与释放有关。
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