摘要
糖代谢失衡等相关慢性病成为威胁人类健康的突出问题。α-淀粉酶是消化系统中催化淀粉水解的关键酶。当人体摄入过量的碳水化合物时，会导致消化吸收的葡萄糖过多，进而导致血糖升高，α-淀粉酶抑制剂可以有效延缓淀粉消化，减少体内葡萄糖吸收，降低餐后血糖水平，对于高血糖人群以及肥胖人群具有重要意义。纳米颗粒（NPs）具有尺寸小、生物相容性好、结晶度高且不易被酶分解等优点，作为一种有效的α-淀粉酶抑制剂受到广泛关注。本课题以β-环糊精（β-CD）为原料，通过干热酯化法制备了琥珀酸改性的环糊精（SACD），并通过反溶剂沉淀法制备了大豆多肽（SPT）-SACD复合纳米颗粒（SPT-SACD NPs），对SPT-SACD NPs的形貌、粒径、Zeta电位、热稳定性、结晶性等理化性质进行表征；通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）、紫外-可见（UV-vis）光谱、荧光光谱、同步荧光光谱、热力学分析、圆二色（CD）光谱等探究了SPT-SACD NPs与α-淀粉酶的相互作用，进一步探究SPT-SACD NPs与小分子多酚（表没食子儿茶素没食子酸酯：EGCG）结合对α-淀粉酶活性的影响；制备了SPT-SACD与葡萄籽原花青素（GSP）复合NPs（SPT-SACD-GSP），探究了SPT-SACD-GSP对α-淀粉酶的相互作用，研究SPT-SACD-GSP对α-淀粉酶的抑制动力学，并利用Cornish-Bowden方程、Lineweaver-Burk双倒数方程、Dixon方程阐明了对α-淀粉酶的抑制机理。主要研究内容及结果如下： 首先制备了不同SPT平均分子量（SPT1-300Da、SPT2-500Da、SPT3-1500Da）及不同SPT/SACD质量比（0.5:1、1:1、2:1、3:1）的SPT-SACD NPs，通过动态光散射（DLS）、扫描电子显微镜（SEM）、热重分析（TGA）、X-射线衍射（XRD）、FTIR对SPT-SACD NPs的理化性质进行表征。DLS结果表明，由平均分子量为300Da和500Da的SPT制备的SPT-SACD NPs的粒径在400nm以内，SPT3-SACD NPs粒径最大。当SPT/SACD质量比为2:1、SPT分子量为300Da时，制备的NPs粒径最小，为297nm，并呈现良好的单峰分布。SEM结果显示NPs呈类似球形的颗粒结构；Zeta表面电位表明随着SPT/SACD质量比减小，SPT-SACD NPs所带的负电荷更大；XRD表明SPT-SACD NPs的结晶结构基本消失；FTIR结果显示，与SACD相比，SPT-SACD NPs的羟基峰波长明显减小，表明SPT-SACD NPs氢键作用增强；TGA表明，与单独的SPT相比，SPT-SACD NPs具有更好的热稳定性。 通过UV-vis光谱、FTIR、荧光光谱、同步荧光光谱、热力学分析、CD光谱等探究了不同质量比的SPT1-SACD NPs以及不同浓度的SPT1-SACD（2:1）NPs与α-淀粉酶间的相互作用，并初步探究了SPT1-SACD（2:1）NPs在小分子多酚（EGCG）抑酶体系中的作用。UV-vis光谱在260nm处的峰值强度逐渐增加并产生红移，表明酶和SPT1-SACD NPs之间存在相互作用并形成了新的复合物，NPs对酶蛋白中芳香族氨基酸残基的微环境产生影响；FTIR表明二者的相互作用使得酶的酰胺I带、II带以及C-H伸缩振动发生变化，NPs改变了酶蛋白的二级结构；CD光谱进一步证实了该结果；荧光光谱表明，SPT1-SACD NPs的加入引起了酶蛋白的荧光淬灭，随着SPT1/SACD质量比的减小、SPT1-SACD（2:1）NPs浓度的增大，淬灭作用越强烈；同步荧光光谱出现红移，并显示对色氨酸（Trp）荧光的淬灭作用大于酪氨酸（Tyr），表明NPs可以更加有效地降低Trp残基周围的疏水性；荧光淬灭和热力学分析表明NPs通过与酶形成复合物静态淬灭酶的内源荧光，焓变（ΔH）和熵变（ΔS）均小于0，二者间的相互作用由氢键和范德华力驱动。酶活力分析实验表明，SPT-SACD NPs显著提高了EGCG对α-淀粉酶的抑制作用，半抑制浓度（IC50）从0.324mg/mL降至0.248mg/mL。 通过制备SPT-SACD-GSP复合NPs，对SPT-SACD-GSP NPs的理化性质进行了表征，探究了SPT-SACD-GSP对α-淀粉酶的相互作用，并阐明了其对酶的抑制机制。DLS表明SPT1-SACD-GSP的粒径相对较小，均匀分散程度较好；SEM下的微观结构呈现球状，粒径在400nm以内；TGA显示SPT-SACD-GSP热稳定性得到提高。通过探究对α-淀粉酶的抑制作用，单独GSP的最大抑制率（81.3%）小于SPT-SACD-GSP NPs（5:1）的最大抑制率（87.2%），且IC50值由6.96μg/mL降至2.56μg/mL，SPT-SACD NPs可以提高GSP抑制α-淀粉酶活力的能力；抑制动力学结果表明SPT-SACD-GSP NPs对α-淀粉酶的抑制是一种混合型竞争性抑制，且非竞争性抑制常数（Kiu=103μg/mL）大于竞争性抑制常数（Kic=40μg/mL）；在对温度的稳定性研究中，当温度为90°C时，GSP和SPT-SACD-GSP的抑制活性较30°C时分别下降了61.4%和50.1%，高温下的SPT-SACD-GSP的更稳定；多种光谱分析和热力学分析表明，二者间的相互作用形成了新的复合物，并由氢键和范德华力驱动；FTIR和CD光谱表明二者的相互作用改变了酶的二级结构。本研究有助于增加对多肽-环糊精复合物与消化酶之间相互作用机制的理解，了解NPs对酶结构和功能的影响，为功能性食品的设计与开发提供理论基础。
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