摘要
目的：本研究以从“肝脾”论治慢性萎缩性胃炎（Chronicatrophicgastritis，CAG）伴肠上皮化生（Intestinalmetaplasia，IM）为理论基础，旨在通过回顾性研究评估柴芍六君子汤加减（ModifiedChaishaoLiujunziDecoction，MCLD）治疗CAG伴IM的有效性及安全性，借助网络药理学预测MCLD治疗本病的潜在作用机制，并开展体外实验研究，拟从细胞分子水平对该调控机制进行验证，以为MCLD临床治疗CAG伴IM提供理论、循证和实验支撑。 方法： 1.采用回顾性研究，观察MCLD对92例肝郁脾虚型CAG伴IM患者病理组织学改善率、稳定率、进展率、病理组织学积分、中医症状积分及中医证候疗效的影响，并记录不良反应发生情况。 2.利用TCMSP、PubChem和SwissTargetPrediction数据库获取MCLD的活性成分及其对应的靶点蛋白，利用GeneCards和OMIM数据库收集CAG伴IM的靶点蛋白，绘制韦恩图以获取潜在作用靶点；采用STRING数据库和Cytoscape3.7.2软件构建网络、筛选核心靶点、分析主要活性成分；借助Metascape平台进行GO富集分析和KEGG通路富集分析；预测MCLD干预CAG伴IM的潜在机制。 3.采用MTT法检测不同浓度脱氧胆酸（deoxycholicacid，DCA）和MCLD对人胃上皮细胞-GES-1活力的影响；利用RT-qPCR和Westernblot检测肠道特异性标志物CDX2和MUC2的表达水平以确定DCA诱导GES-1细胞向IM转化的最佳浓度；通过RT-qPCR和ELISA检测确定MCLD抑制DCA诱导IM和炎性反应的最佳浓度；利用Westernblot检测EGFR、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、CDX2及MUC2的蛋白表达水平以阐明MCLD对EGFR/PI3K/AKT/mTOR通路的影响及其干预IM的分子机制。 结果： 1.基于OLGA和OLGIM分级分期系统，MCLD干预后胃粘膜萎缩和IM的改善率分别为63.04％（58/92）和48.91％（45/92），CAG伴IM的总体改善率为63.04%（58/92），治疗前后病例分期高低构成比差异有统计学意义（P＜0.05）；同时，MCLD显著降低了萎缩、肠化生及慢性炎症的病理组织学积分和中医症状积分，差异均有统计学意义（P＜0.05），且中医证候疗效的总有效率为92.39%（85/92）；此外，2例患者出现腹泻症状，MCLD不良反应症状的发生率为2.17%（2/92）。 2.网络药理学共预测141种MCLD活性成分，815个药物靶点蛋白，1677个疾病靶点蛋白和267个潜在作用靶点。GO富集分析主要涉及的生物学功能包括细胞对有机氮化合物的反应、细胞迁移的正调节、蛋白磷酸化的正向调控等；KEGG通路富集分析结果表明MCLD干预CAG伴IM的主要通路为癌症通路和PI3K-Akt信号通路；根据PPI网络最终获得39个核心靶点蛋白，基于“成分-靶点-通路”网络推测MCLD干预CAG伴IM的主要有效成分包括槲皮素、山奈酚、异鼠李素和木犀草素等；最终推测MCLD可能通过EGFR/PI3K/AKT/mTOR通路干预CAG伴IM。 3.体外研究结果显示：低剂量DCA（≤200μM）可促进GES-1细胞增殖，且无毒性作用，200μg/mL及以下MCLD浓度对细胞活力无影响，可分别用于后续实验研究；DCA（0、50、100和150μM）处理GES-1细胞可以诱导CDX2和MUC2的mRNA和蛋白质表达水平以剂量依赖性方式上调，150μMDCA组显著高于空白对照组（P＜0.05），后续实验选择150μMDCA进行研究；RT-qPCR及ELISA检测结果表明，MCLD可抑制DCA诱导的CDX2和MUC2mRNA表达及炎性标志物含量，150μg/mLMCLD处理结果最为显著（P＜0.05），选择该浓度进行机制验证；Westernblot检测结果表明，MCLD可降低DCA诱导的CDX2、MUC2、EGFE、PI3K、p-Akt、p-mTOR的蛋白表达水平（P＜0.05），并与EGFR激动剂处理结果相反（P＜0.05），且与EGFR激动剂处理相比，中药+EGFR激动剂同样显著降低了上述蛋白的表达水平（P＜0.05）。 结论：1.回顾性研究表明MCLD可逆转部分CAG伴IM患者的胃黏膜萎缩和肠上皮化生，改善中医症状，安全性良好，表明该方可能为治疗CAG伴IM的潜在有效方剂，值得对其进一步深入研究；2.网络药理学预测结果提示MCLD干预CAG伴IM的潜在作用机制可能与EGFR/PI3K/AKT/mTOR途径相关。3.体外实验验证结果提示MCLD可能通过负调控EGFR/PI3K/AKT/mTOR通路，抑制CDX2和MUC2表达，从而改善DCA诱导的IM。
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