摘要
研究背景： 宫颈癌(Cervicalcancer,CC)发病率、死亡率持续攀升，如何实现放射增敏防治宫颈癌恶性进展一直是我国妇科肿瘤领域难以解决的重大科学问题，至今尚无突破性进展。 放射治疗(Radiationtherapy,RT)通过直接作用造成DNA损伤和间接作用产生自由基导致细胞损伤。放射治疗作为一种局部治疗手段，创伤和系统毒副作用相对较小。但目前宫颈癌的放疗存在难以克服的难点诸如： ①晚期患者放疗失败率高；②产生辐射抵抗，导致肿瘤的局部未控、复发和远处转移；③放疗后复发患者局部正常组织的辐射耐受性下降等。 有研究报道，宫颈癌患者中放疗抵抗的比例约26.67~52%。放疗抵抗的患者会对辐射产生抵抗，使得放疗疗效不佳，容易出现复发和转移。而对于放疗后复发的患者，放疗抵抗比例更高，预后更差，其5年生存率仅为3.2%~13.0%。因此寻找一种能逆转放疗抵抗、增敏放疗的治疗手段彰显重要。 放射动力治疗(Radiodynamictherapy,RDT)是一种新兴的抗癌治疗方法。其可通过低剂量X-ray与光敏剂(Photosensitizer,PS)药物整合、相互作用后在其病变部位产生大量活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)实现杀伤肿瘤细胞。在经典的RDT中，通常使用装载传统PS的纳米闪烁体材料来产生单线态氧(singletoxygen,1O2)。但传统的纳米闪烁体材料需要将X射线转换为低能光子(紫外线至近红外范围，UV-NIR)才能激发光敏剂引发RDT，这样会造成能量的损耗。 吖啶橙(AcridineOrange,AO)是一种可以直接被X-ray激活的光敏剂，通过RDT将胞浆内的氧转化为ROS(主要为1O2)发挥肿瘤杀伤作用。但AO对人体正常组织和细胞具有较大毒性。 因此基于上述，本文设想:X-ray直接激发的光敏剂，既能避免纳米闪烁体材料的引入，又能提高X-ray的利用率，避免能量的损耗。采用纳米粒子包裹吖啶橙，通过X-ray照射在肿瘤部位靶向释放，既能使AO在肿瘤局部蓄积，又能减少全身毒性。多模式整合实现交叉融合、优势互补、增敏增效，有可能实现减轻全身毒性，提高RDT的效率，增敏放射治疗，逆转中晚期宫颈癌放疗抵抗提高宫颈癌治愈率等目的。 同时，通过RDT在宫颈癌中的研究提出RDT逆转放疗抵抗新机制将拓展RDT增敏放疗在其他癌症和放疗后复发宫颈癌中的放疗应用，前景可观。 研究目的： 本研究通过合成包裹AO的二硒键桥联介孔有机二氧化硅纳米颗粒(AOcoateddiselenium-bondedbridgingmesoporousorganosilicananoparticles,MON@AO)，观察MON@AO的表征和在X-ray和肿瘤微环境中双重响应释放性能，分别在体外、体内探索其在宫颈癌SiHa细胞和辐射抗性R-SiHa细胞中发挥辐射增敏的作用和机制，为寻找能逆转放疗抵抗，实现辐射增敏，提高放疗疗效，改善患者预后的放疗增敏剂提供理论依据。 研究方法： 1.合成MON@AO并检测其表征，对细胞增殖活性影响及体内毒性评估 我们将含二硒键的有机二氧化硅片段引入介孔二氧化硅框架中，然后包裹吖啶橙(AO)，设计合成了包裹AO二硒键桥联的介孔粒子(MON@AO)。通过对其尺寸、元素分布、光谱测试、包裹率、响应释药等多种方式检测MON@AO的性能。 通过CCK-8检测MON@AO对SiHa细胞增殖活性的影响。通过腹腔注射MON@AO模拟全身给药，观察记录裸鼠注射纳米粒子前后精神、进食、饮水状态，皮毛变化。通过体重变化变化，评估MON@AO的体内毒性。 2.探讨MON@AO在宫颈癌SiHa细胞中的放疗增敏作用 通过以下体外实验，如CCK-8、克隆形成、DNA损伤及修复、细胞凋亡、周期进程、1O2、ROS、线粒体膜电位、自噬(MDC法)、WesternBlot等技术探讨MON@AO对宫颈癌SiHa细胞的放疗增敏作用及机制。 3.分析放疗后复发宫颈癌患者再程放疗预后、毒副作用及辐射抗性对预后的影响 通过23例放疗后复发宫颈癌患者再放疗的临床随访数据总结其预后、毒副作用及辐射抗性对预后的影响。 4.构建辐射抗性R-SiHa细胞，并探讨MON@AO在宫颈癌R-SiHa细胞中的辐射增敏作用 分次大剂量照射(每次4Gy，共8次，总剂量32Gy)构建R-SiHa细胞模型，并通过CCK-8、克隆形成、细胞凋亡和细胞周期检测鉴定辐射抗性模型建立成功。 通过以下体外实验，如CCK-8、克隆形成、DNA损伤及修复、细胞凋亡、周期进程、1O2、ROS、线粒体膜电位、自噬(MDC法)、WesternBlot等技术探讨MON@AO改善宫颈癌R-SiHa细胞辐射抗性，放疗增敏作用及机制。 5.验证MON@AO对人子宫颈癌辐射抗性细胞裸鼠移植瘤有放疗增敏抑瘤作用 通过建立人子宫颈癌辐射抗性细胞裸鼠移植瘤模型，验证MON@AO联合X-ray对子宫颈癌辐射抗性细胞裸鼠移植瘤抑瘤效果。并应用TUNEL染色、HE染色及免疫组化法进一步验证对子宫颈癌辐射抗性细胞的放疗增敏作用。 研究结果： 1.成功合成毒性较低的双重响应性释放的MON@AO MON@AO平均粒径约为70nm，分别在1080cm-1处出现了Si-OH的特征振动峰，并且在750cm-1处出现Se-Se的特征振动峰，AO包覆率达83.2%，在H2O2环境下并给予X-ray照射，其释放率高达86%。MON@AO较AO在体内外实验中具有更低的毒性。确定后续体外实验采用MON@AO和AO的浓度分别为0.5μM和0.25μM。体内实验采用的MON@AO和AO的浓度分别为40mg/kg和20mg/kg。 2.MON@AO在宫颈癌SiHa细胞中的辐射增敏作用 MON@AO联合X-ray协同抑制SiHa细胞存活率和细胞增殖活性。MON@AO联合X-ray抑制DNA损伤修复、诱导G2/M期阻滞、促进细胞凋亡、影响线粒体功能(产生1O2、ROS升高、线粒体膜电位下降)、激活线粒体自噬。MON@AO联合X-ray组抑制了与G2/M期阻滞相关的CyclinB1和CDK1蛋白的表达，抑制了乏氧诱导因子HIF-1α的表达，促进了与细胞凋亡相关的p65蛋白质的表达。大量的ROS通过Pink1/Parkin信号通路调控引起线粒体自噬(p62、Parkin表达下降，Pink1表达升高)影响线粒体功能(线粒体膜电位下降)。MON@AO联合X-ray还抑制了PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白和COX2蛋白表达(PI3K、Akt、mTOR、COX2表达均下降)。 3.放疗后复发宫颈癌患者再放疗的毒副作用和预后 通过23例放疗后复发宫颈癌患者再放疗的临床随访数据总结其预后、毒副作用及辐射抗性对预后的影响。1年、2年、3年和4年的PRS率分别为65.2%、43.5%、33.8%和27.1%。39.1%的患者发生了3-4级的晚期毒性反应。43.5%的患者属于放疗抵抗组。放疗抵抗影响预后，放疗抵抗患者的死亡风险比放疗敏感患者的高3.617倍。 4.MON@AO在宫颈癌R-SiHa细胞中的辐射增敏作用 R-SiHa细胞相比SiHa细胞存活率和增殖活性有显著提高，而凋亡发生率更低，G2/M期的比例更少。 MON@AO联合X-ray协同抑制R-SiHa细胞存活率和细胞增殖活性。MON@AO显著抑制了辐射诱导的DNA损伤修复、增强了辐射诱导的G2/M期阻滞和细胞凋亡、影响线粒体功能(1O2、ROS水平升高、线粒体膜电位下降)、诱导线粒体自噬。 WesternBlot实验结果显示，MON@AO联合X-ray组抑制与G2/M期阻滞相关的CyclinB1和CDK1蛋白的表达，抑制乏氧诱导因子HIF-1α的表达，促进了与细胞凋亡相关的p65蛋白质的表达。大量的ROS通过Pink1/Parkin信号通路激活线粒体自噬(p62、Parkin表达下降，Pink1表达升高)影响线粒体功能(线粒体膜电位下降)。抑制了PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白和COX2(PI3K、Akt、mTOR、COX2表达均下降)表达。 5.MON@AO对人子宫颈癌辐射抗性细胞裸鼠移植瘤的放疗增敏抑瘤作用 在体内实验中，MON@AO联合X-ray对子宫颈癌辐射抗性细胞裸鼠移植瘤有明显抑瘤效果，有抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，促进细胞坏死的作用。。MON@AO组与AO组，MON@AO+6Gy组与AO+6Gy组，两者相比裸鼠体重均无明显差异。MON@AO与X-ray联合应用未造成各个脏器的系统性毒副作用。 结论： 1．成功合成具有X-ray和肿瘤微环境双响应释放特性的MON@AO。 2．放疗后复发宫颈癌患者近半数属于放疗抵抗，预后不佳，毒副作用较大。 3．MON@AO通过抑制DNA损伤修复、诱导G2/M期阻滞、促进细胞凋亡、影响线粒体功能(产生1O2、ROS升高、线粒体膜电位下降)、激活Pink1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬、抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，起到逆转放疗抵抗、辐射增敏作用。 4．MON@AO可增强X-ray对宫颈癌辐射抗性细胞裸鼠移植瘤的抑瘤作用，促进X-ray对宫颈癌辐射抗性细胞裸鼠移植瘤的凋亡坏死作用。 创新性： 1．原创性提出并验证基于响应释放吖啶橙增敏宫颈癌放射动力治疗机制。 2．制备了基于X射线和肿瘤微环境双重响应释放的纳米颗粒MON@AO。 应用X射线进行放射治疗时，X射线不仅能发挥在肿瘤部位响应释放MON@AO中包裹的AO的作用，X射线还能通过激活光敏剂AO发挥放射动力治疗。既提高了AO的靶向性，又降低了AO的全身毒性。 3．通过放射动力治疗逆转放疗抵抗，促进宫颈癌辐射增敏具有原创性意义。
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