摘要
背景和目的： 本课题组围绕晚期难治性肿瘤开创了一系列临床试验（注册号：ChiCTR1900026175/NCT04892498/NCT05115500），源于这些临床试验中都联合应用了 PD-1 抑制剂、放射治疗（ Radiotherapy ）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（ Granulocyte macrophage-colony stimulating factor, GM-CSF ），而 PD-1 inhibitor, Radiotherapy and GM-CSF的首字母组合为“PRaG”，又因“布拉格峰”在放射治疗中具有重要意义，所以命名为“布拉格治疗”。尽管我们在布拉格治疗的系列临床试验中发现：布拉格治疗对于晚期结肠癌具有较好的疗效，但由于上述临床试验都是单臂研究，缺少对照，为进一步证实布拉格治疗的疗效，我们设计了本课题，期望通过对小鼠结肠癌转移模型的研究，证实布拉格治疗应用于晚期结肠癌的科学性，并初步探索其相关机制。 第一部分 转移性结肠癌小鼠模型构建及布拉格治疗疗效确认 方法： 1. 小鼠结肠癌皮下转移瘤模型构建及布拉格治疗方案的实施：培养CT26.WT细胞，于实验小鼠右侧臀部皮下接种CT26.WT细胞（3×105个），3天后于左侧臀部皮下接种相同数量CT26.WT细胞，构建小鼠结肠癌皮下转移瘤模型。对所有小鼠按实验计划分为七组，即对照组（CON），PD-1抑制剂单药组（P），PD-1抑制剂联合GM-CSF组（PG），放疗组（Ra），放疗联合GM-CSF组（RaG），放疗联合PD-1抑制剂组（PRa），放疗联合PD-1抑制剂和GM-CSF组（PRaG）。具体治疗流程如下：按每组计划方案执行。右侧皮下瘤接种后第7-9天，需行放疗组选取小鼠右侧皮下种植瘤行放疗，放疗方案为（8Gy×3Fx），其他非放疗组不做任何治疗处理；第十天开始上述七组按治疗计划行序贯免疫治疗，以3天为一周期，即第一、二天按计划腹腔注射鼠源GM-CSF（100ng/只），第二天按计划腹腔注射鼠源PD-1抑制剂（0.5mg/kg/只），上述免疫治疗共行四周期。 2. 小鼠结肠癌腹腔转移瘤模型构建及布拉格治疗方案的实施：培养CT26.WT/CT26.LUC细胞，于髂前上棘连线腹中线偏左处腹腔注射CT26.WT细胞（1×105个），构建小鼠结肠癌腹腔转移瘤模型。对所有小鼠按实验计划分为六组，即对照组（CON），PD-1抑制剂单药组（P），放疗组（Ra），放疗联合GM-CSF组（RaG），放疗联合PD-1抑制剂组（PRa），放疗联合PD-1抑制剂和GM-CSF组（PRaG）。具体治疗流程如下：按每组计划方案执行。细胞接种后第7-9天，需行放疗组选取低位约10%腹腔体积行放疗，放疗方案为（8Gy×3Fx），其他非放疗组不做任何治疗处理；第十天开始上述六组按治疗计划行序贯免疫治疗，以3天为一周期，即第一、二天按计划腹腔注射鼠源GM-CSF（100ng/只），第二天按计划腹腔注射鼠源PD-1抑制剂（0.5mg/kg/只），上述免疫治疗共行四周期。 3. 应用游标卡尺测量皮下转移瘤模型小鼠的肿瘤短径与长径，绘制皮下瘤生长曲线。 4. 应用CT26.LUC细胞建立腹腔转移瘤模型小鼠，腹腔注射荧光素钾盐（3mg/只），利用化学发光成像仪检测腹腔肿瘤荧光强度，评估肿瘤负荷。 5. 选择皮下转移瘤模型小鼠，在双侧皮下转移瘤均消退后100天，再次皮下接种CT26.WT细胞，记录肿瘤生长情况。 结果： 1. 在皮下转移瘤模型中，小鼠经布拉格治疗后与其他组相比，其照射侧及非照射侧瘤体生长均受显著抑制。57.1%小鼠获得了全身治愈（无瘤长期存活＞100天），治愈率显著高于其他各组。以肿瘤体积＞2000mm3作为伦理死亡标准，布拉格治疗组较其他各组显著延长小鼠的生存期。 2. 在腹腔转移瘤模型中，布拉格治疗显著降低小鼠腹腔肿瘤负荷，同时显著延长小鼠生存期。 3. 皮下转移瘤模型下经布拉格治疗治愈的小鼠，再次皮下接种CT26.WT细胞后无法再次成瘤。 小结： 布拉格治疗可显著降低肿瘤负荷并延长双侧皮下瘤及腹腔转移瘤模型小鼠的生存期，同时可诱导小鼠形成肿瘤免疫记忆效应。 第二部分 布拉格治疗对转移性结肠癌小鼠模型中免疫抑制性细胞的影响 方法： 1. 小鼠皮下转移瘤模型构建及布拉格治疗见第一部分。对所有小鼠按实验计划分为四组，即对照组（CON），PD-1抑制剂单药组（P），放疗联合PD-1抑制剂组（PRa），放疗联合PD-1抑制剂和GM-CSF组（PRaG）。 2. 布拉格治疗结束后第二天分离小鼠脾脏、非照射侧肿瘤和非照射侧腹股沟淋巴结，制备成细胞悬液，进行流式抗体染色，通过流式细胞术检测样本中骨髓来源抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor cells, MDSCs）比例。 结果： 1. 与PD-1抑制剂、PD-1抑制剂+放疗组相比，布拉格治疗可显著降低荷瘤小鼠脾脏和未照射侧肿瘤中的髓源抑制性细胞MDSCs比例。 小结： 小鼠结肠癌皮下转移瘤模型中，布拉格治疗可以减少脾脏及未照射侧肿瘤中免疫抑制性细胞MDSCs的比例，可能有助于改善系统免疫状态及肿瘤免疫微环境。 第三部分 布拉格治疗对转移性结肠癌小鼠模型中肿瘤代谢组学的影响 方法： 1. 小鼠结肠癌腹腔转移瘤模型构建及布拉格治疗见第一部分。对所有小鼠按实验计划分为五组，即照组（CON），PD-1抑制剂单药组（P），单纯放疗组（Ra），放疗联合PD-1抑制剂组（PRa），放疗联合PD-1抑制剂和GM-CSF组（PRaG）。 2. 治疗结束后第二天分离小鼠腹腔肿瘤，利用基于超高效液相-质谱联用平台的非靶向代谢组学技术分析肿瘤样本，进行多元变量统计分析，进一步鉴定差异代谢产物及相关代谢通路。 结果： 1. 在正离子及负离子模式下，布拉格治疗组小鼠与对照组、PD-1抑制剂组、放疗组、PD-1抑制剂+放疗组相比，腹腔肿瘤代谢物在主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）、偏最小二乘法-判别分析（partial least squares-discriiminate analysis, PLS-DA ）、正交-偏最小二乘判别分析（ Orthogonal Projections to Latent Structures Discriminant Analysis, OPLS-DA）分析中均出现了显著改变。 2. 差异代谢物鉴定结果提示布拉格治疗可提高肿瘤中N-甲基-2-吡咯烷酮（N-Methyl-2-pyrrolidinone , NMP）、S-乳糖基谷胱甘肽（S-Lactoylglutathione）、4-羟基苯甲酸（4-Hydroxybenzoic acid）含量，降低十六醇（1-Hexadecanol）含量。 小结： 布拉格治疗可改变肿瘤组织代谢状态，增加抗肿瘤代谢物含量，降低促肿瘤代谢物含量，可能有助于肿瘤免疫治疗。 结论： 本实验条件下，布拉格治疗可显著延长结肠癌转移模型小鼠的生存期，并诱导肿瘤免疫记忆效应的形成，有利于晚期肿瘤的控制。该治疗方案可减少脾脏及肿瘤中MDSCs的比例并改变肿瘤代谢轮廓。
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