摘要
目的： 三阴性乳腺癌（Triple negative breast cancer,TNBC）在乳腺癌中占 15%-20%，1-3 年内容易复发和转移，因缺少有效的治疗靶点，三阴性乳腺癌的治疗是当前的一个研究热点。肿瘤微环境（Tumor Microenvironment，TME）的重编程对肿瘤侵袭有一定的影响，对肿瘤转移有显著作用，其中成纤维细胞在其中发挥着关键作用。本研究拟通过体内外实验探索三阴性乳腺癌外泌体传输整合素β2（Integrin β2，ITGB2）激活成纤维细胞（Normal Fibroblast, NF）促进肿瘤转移机制，为三阴性乳腺癌寻找新的治疗靶点。 方法： 第一部分：对 3 名 TNBC 患者和 3 名健康对照者血清外泌体（Exosome, EX）进行蛋白组学分析，筛选与肿瘤微环境调控相关的标志物ITGB2、c-Myc，并应用实时荧光定量 PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR，RT-PCR）和蛋白印迹（Western Blot，WB）实验分析 ITGB2、c-Myc 在 TNBC 外泌体、组织、细胞中的表达水平；免疫组化染色分析组织中的ITGB2与TNBC患者预后及临床病理特征间的关系。 第二部分：通过构建c-Myc稳定低表达的TNBC细胞，应用CCK-8、细胞侵袭、转移实验分析c-Myc表达改变后对TNBC细胞增殖、侵袭能力的影响。对敲除c-Myc的TNBC细胞系进行转录组测序分析，应用GO分析、KEGG分析、PPI网络蛋白分析等生信分析软件探索TNBC中与c-Myc表达相关的mRNA，分析c-Myc作为转录因子调控肿瘤微环境中基因表达的可能机制，通过WB验证c-Myc敲除后对ITGB2表达的影响。 第三部分：构建了ITGB2稳定高表达和低表达的TNBC细胞，将高表达和低表达ITGB2的TNBC细胞外泌体和NF进行共培养，分析ITGB2高表达促进TNBC基质纤维化相关机制，采用激光共聚焦显微镜观察 NF 吞噬 TNBC 外泌体，激活肿瘤相关成纤维细胞（Cancer-associated Fibroblast, CAF）过程，CCK-8、Transwell 实验分析TNBC外泌体高表达ITGB2对CAF增殖、迁移与侵袭能力的影响；通过构建ITGB2高表达、低表达的TNBC裸鼠脂肪垫成瘤模型，通过体内实验分析ITGB2对肿瘤生长以及肿瘤微环境中CAF激活调控的作用机制。 结果： 第一部分：血清外泌体蛋白组学研究结果表明，三阴性乳腺癌和健康人群外泌体相比较，共鉴定出90个差异表达蛋白，其中差异表达蛋白质上调48个，下调表达蛋白42个。涉及细胞粘附、生物过程的正向调控、免疫应答过程等重要生物学过程。通过生物信息学分析，筛选出与三阴性乳腺癌肿瘤微环境调控相关的基因有c-Myc、ITGB2等，经验证三阴性乳腺癌细胞（0.738±0.070 vs 0.107±0.018,P=0.000）、组织（0.271±0.026 vs 0.094±0.011,P=0.000）、外泌体（0.701±0.052 vs 0.368± 0.017,P=0.013）中ITGB2和c-Myc表达量均显著升高。且ITGB2高表达与三阴性乳腺癌不良预后正相关（R=0.41，P=0.0021）。 第二部分：敲除 c-Myc 后可显著抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、侵袭能力。转录组测序分析结果显示c-Myc敲除组与对照组相比，转录组测序筛选出276个差异性表达mRNA，其中152个mRNA显著上调，124个mRNA显著下调，应用KEGG、GO分析、PPI蛋白网络分析发现c-Myc可转录调控的基因有BMP4、CAMP、FOXQ1、GNG4、ITGB2 等，经 WB 验证发现 c-Myc敲除后 ITGB2表达下调（0.430±0.032 vs 0.259±0.015，p=0.00）。 第三部分：将敲除或过表达ITGB2的TNBC细胞外泌体与NF共培养，过表达ITGB2可促进NF向CAFs的活化，并进一步增强CAFs的增殖、侵袭、转移能力。ITGB2 敲除的 TNBC 细胞对 NF 激活作用减弱（35.111±1.167 vs 31.667± 0.707,p＜0.05）。激光共聚焦显微镜观察到ITGB2敲除后NF内吞外泌体量减少，说明TNBC外泌体通过ITGB2与成纤维细胞结合，启动膜融合，被成纤维细胞吞噬。通过裸鼠成瘤实验发现，高表达ITGB2组裸鼠瘤体体积最大，敲除ITGB2后显著抑制肿瘤生长，瘤体体积较小，ITGB2敲除后瘤体肿瘤相关成纤维细胞标记物α-SMA、FAP、FSP 表达水平下调(1.097±0.050 vs 0.893±0.025 , 1.082±0.068 vs 0.825± 0.054,0.608±0.005 vs 0.480±0.032,p＜0.05)，提示 ITGB2 敲除后抑制肿瘤微环境中CAFs激活。 结论： 第一部分：TNBC 外泌体与健康人外泌体蛋白组成存在显著差异，其中差异蛋白c-Myc和ITGB2在三阴性乳腺癌组织、细胞、外泌体中均呈高表达，ITGB2高表达与TNBC不良预后正相关。 第二部分：通过敲除 c-Myc 后对 TNBC 细胞进行转录组学分析发现 ITGB2 与c-Myc间可能存在调控关系，敲除c-Myc可抑制ITGB2基因表达。 第三部分：TNBC细胞分泌的外泌体可通过ITGB2被肿瘤微环境中的NF吞噬，激活NF转化为CAF，促进肿瘤的发生发展及转移。
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