摘要
牛初乳一种具有很高营养价值的物质.但是牛初乳免疫活性物质生物利用率低,从而影响其免疫功能.针对该问题本研究拟制备牛初乳脂质体缓释牛初乳免疫活性物质,并提高其生物利用度和免疫功能.本文主要结果如下: 1、牛初乳脂质体的制备.基于牛初乳脂质体蛋白质包封率,从薄膜分散法、有机溶剂注入法和逆向蒸发法中筛选出了牛初乳脂质体的最佳制备工艺为逆向蒸发法,该方法制备得到的牛初乳脂质体包封率高,达到了(44.12±2.44)%.利用单因素分析法考察了大豆磷脂含量、牛初乳含量、有机相(溶解大豆磷脂的有机溶剂)体积和超声时间对牛初乳脂质体蛋白质包封率的影响,利用响应面设计分析和模型拟合,筛选出制备牛初乳脂质体的最优配方为:磷脂含量74.9 mg,牛初乳含量6.152 mg/mL,有机溶剂的体积为6.25 mL时得到的牛初乳脂质体蛋白质包封率最高,此时蛋白包封率为(44.12±2.44)%,免疫球蛋白G(IgG)包封率(24.7±7.5)%,为了适应食品企业生产,课题进一步优化了牛初乳脂质体的制备工艺与方法,采用无有机溶剂的大豆油溶解磷脂与β-谷甾醇后与适量牛初乳混合探头超声10min形成稳定的乳液,在旋转蒸发仪上定容至10 mL,最终制备牛初乳脂质体的蛋白包封率为(57.02±1.22)%,IgG包封率(49.03±1.55)%,最终选取无有机溶剂的方法进行后续实验.激光共聚焦显微镜(CLSM)显示牛初乳脂质体呈圆形,外观平滑完整,傅里叶红外光谱结果表明牛初乳的C=O与与磷脂中的PO42-发生了反应,并通过氢键与磷酸根结合,证实磷脂包埋了牛初乳. 2、牛初乳脂质体体外消化的研究.课题采用静态体外消化,通过测定消化过程中粒径、电势、蛋白质条带和IgG含量的变化,探究牛初乳与牛初乳脂质体的消化特性.结果发现牛初乳脂质体粒径在胃消化阶段基本保持不变,但在肠消化阶段由于胰脂酶与胆盐的存在导致粒径先变大后又逐渐减小,由于牛初乳中蛋白质在低pH下带正电荷,所以牛初乳脂质体在模拟胃消化阶段的电位为正,进入肠液后产生溶血磷脂导致电位显著下降,通过SDS-PAGE结果显示由脂质体包裹的牛初乳IgG在肠消化阶段存留的时间比未被包裹的牛初乳长,说明脂质体保护了牛初乳的功能性物质使其缓释.CLSM结果显示牛初乳脂质体在胃消化阶段保持基本完整,而在到达肠液后由于胰脂酶与胆盐的存在使脂质体被破环,牛初乳被释放. 3、牛初乳脂质体体内消化吸收特性及IgG生物利用度的研究.通过给小鼠灌胃牛初乳与牛初乳脂质体,测定0h、0.5h、1h、2h、3h、5h、7h、9h、12 h血清中IgG的含量,研究牛初乳脂质体IgG在体内的消化吸收特性.结果表明牛初乳组的小鼠血清中IgG含量在0.5 h浓度达到顶峰,而牛初乳脂质体组在2 h达到最大值;12 h后牛初乳脂质体血清中IgG含量显著高于牛初乳组;12 h内牛初乳组的曲线下面积为144.07625,牛初乳脂质体组曲线下面积为164.4855,说明牛初乳脂质体组IgG吸收高于牛初乳组,且实现了IgG缓释效果.此外,我们对消化2h小鼠肠内容物肽段进行了分析,结果表明牛初乳消化2h肠内容物的短链肽段数量比牛初乳脂质体的多,此外通过Peptide Ranker和 Biopep在线软件分析免疫活性肽段,结果发现与免疫相关的肽段有GFLP、TGLF、GFLV、SAPRHGSLGFLPR,HGSLGFLPR和TPGFL,其中牛初乳脂质体组含有5个具有免疫活性的肽段,牛初乳组含有4个具有免疫活性的肽段,且牛初乳脂质体组免疫活性肽段丰度显著高于牛初乳组,该结果揭示牛初乳脂质体的免疫活性可能高于牛初乳.接着通过小鼠代谢实验来考察牛初乳脂质体IgG的生物利用度,结果表明牛初乳脂质体对小鼠的体重、摄食量、脏器指数无显著影响,说明牛初乳脂质体对小鼠的生长发育无不良影响,且牛初乳的IgG生物利用度为37.15%,牛初乳脂质体的IgG生物利用度为75.669%,牛初乳脂质体的IgG生物利用度是牛初乳的2.04倍. 4、通过腹腔注射环磷酰胺(CPX)建立免疫抑制小鼠模型,研究牛初乳脂质体对免疫功能的影响.结果发现,牛初乳脂质体对小鼠体重下降、肠道损伤、脾脏肿大、胸腺萎缩均有缓解作用,且牛初乳脂质体的效果显著优于牛初乳.血清及肠道细胞因子、免疫球蛋白的结果表明牛初乳脂质体能够恢复免疫抑制小鼠血清与肠道细胞因子 IL-4、IL-10、TNF-α,IFN-γ与免疫球蛋白IgG和Ig A的表达,改善了Th1/Th2的失调,且效果优于牛初乳.综合结果表明,牛初乳脂质体具有免疫调节功能.
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