摘要
近年来，新发传染病屡见不鲜，种类逐渐增多，流行本底更加复杂，对突发传染病进行有效预防成为人类公共卫生的重大科学问题之一。宁夏作为牛养殖大省，动物疫病始终制约着养牛产业发展。本研究采用病毒宏基因组学方法深入比较分析了宁夏地区奶牛与肉牛病毒病毒群落结构;采用反转录-聚合酶链式反应技术(Reverse transcriptase-Polymerase chain reaction,RT-PCR)对牛腹泻相关病毒进行流行病学调查与遗传进化分析;对牛病毒性腹泻病毒（Bovineviral diarrhea virus,BVDV)阳性样本进行病毒的分离与鉴定;基于重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase polymerase amplification,RPA)建立了 BVDV 可视化检测方法。 通过实验，获得了如下结果: 1. 宁夏地区牛样品高通量测序后注释到病毒序列的contigs数量占总reads数16.89％,肉牛占比 39.40％。共注释到 4 个 Realm、6 个 Kingdom、11 个 Phylum、23 个 Class、33 个 Order、55个Family。注释到动物病毒科22个，牛腹泻病毒科包括黄病毒科、冠状病毒科、杯状病毒科、星状病毒科、呼肠孤病毒科。 2. 针对宁夏地区病毒宏基因组中发现的病毒，通过RT-PCR对BVDV、牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)、牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)、牛诺如病毒(Bovinenorovirus,BNoV)牛星状病毒(Bovineastrovirus,BAstV)等进行病原学调查，结果显示奶牛BVDV、BCoV、BRV、BNoV、BoAstV 阳性率分别为 36.48％、40.88％、4.40％、30.82％、26.42％;肉牛 BVDV、BCoV、BRV、BNoV、BAstV 阳性率分别为 47.48％、30.94％、53.96％、62.59％、33.09％。 3. 将RT-PCR检测BVDV阳性样本接种于牛肾细胞(Madin-darby bovine kidney,MDBK)进行病毒的分离，经生物型、形态学、间接荧光、细胞毒性、RT-PCR鉴定及全基因组进化序列分析，证明成功分离到BVDV-NX株，为50～60 nm圆形有囊膜颗粒，TCID50的效价是10-9.17,分离毒株为BVDV-1d亚型。 4. 建立了 BVDV可视化RPA检测方法，确定BVDV RPA检测最佳反应温度为37℃,最佳反应时间为25 min,凝胶电泳RPA的最低检测阈为1×101 copies/μL,日光下，BVDV SYBR Green Ⅰ可视化最低检测阈为1×109copies/μL;UV下，BVDV SYBR Green Ⅰ最低检测阈1×105 copies/μL。建立的BVDV可视化RPA检测方法特异性良好，临床样品RPA检测与PCR检测阈值相等，可视化明显。 以上这些研究结果显示，宁夏地区奶牛及肉牛携带病毒差异明显;BVDV、BRV、BCoV、BoAstV、BNoV在不同品种、不同地区、不同养殖模式间存在差异;成功分离了 BVDV-NX株;建立的BVDVRPA可视化检测方法，特异性强、灵敏度高，可视化明显。
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