摘要
人类蛋白质组的复杂性由转录后RNA的加工和蛋白质翻译后修饰共同决定。其中，蛋白质翻译后修饰（posttranslational modifications， PTMs）调节蛋白质的功能、运输和相互作用。因此，研究蛋白质的翻译后修饰对于理解复杂的信号转导途径具有重要意义。在过去的几十年里，质谱技术的应用促进了蛋白质组的飞速发展，通过质谱的大规模分析可以确定细胞或组织样本中的数万个修饰位点，为蛋白质的功能解释奠定了基础。然而，主要的技术挑战在于，如何在数百或数千种携带相同 PTMs 的其他蛋白质存在的情况下，选择性地标记或可视化特定蛋白质的PTMs？ 在本论文中，我们利用PTMs和修饰蛋白之间的空间邻近性特点，通过两种不同的标签双重标记蛋白质和PTMs，提出了两种特异性蛋白质PTMs原位成像新方法，简要概述如下： 1 邻位连接介导的滚环扩增（PLA-RCA）策略用于细胞表面特异性蛋白质糖基化原位成像 糖基化PD-L1是免疫检查点阻断疗法更可靠的生物标志物，对肿瘤免疫治疗具有重大意义。但是PD-L1的糖基化阻碍了抗体的识别，因此影响了目前临床上基于抗体的检测方法的准确度。在此，我们提出了一种邻位连接介导的滚环扩增（proximity ligation assay mediated rolling circle amplification，PLA-RCA）策略用于糖基化PD-L1原位成像。该策略依赖一对DNA探针：PD-L1适配体探针用于识别细胞表面PD-L1蛋白；聚糖转换（glycan conversion，GC）探针用于代谢聚糖标记。通过代谢糖标记技术对细胞表面的糖基进行了叠氮标记，使 GC探针和PD-L1适配体探针特异性、高效地附着在细胞膜上。当两个探针同时标记在同一个PD-L1分子上时，引发了邻位连接反应和后续的RCA扩增，从而实现高特异性和高灵敏度的糖基化PD-L1原位成像。另外，该方法成功识别了复杂细胞样本中的PD-L1糖基化阳性细胞，并能够监测药物处理条件下的PD-L1糖基化的变化，推进了与疾病过程相关的动态糖基状态的研究。 2 基于顺式膜的多重荧光共振能量转移（Multi-FRET）策略用于细胞表面特异性蛋白质棕榈酰化成像 棕榈酰化在调节蛋白质的运输、稳定性和活性方面起着重要的作用。目前，蛋白质棕榈酰化研究的主要问题在于缺乏特异性和高灵敏的可视化工具。本课题通过代谢标记和靶向识别特异性棕榈酰化蛋白提出了一种基于顺式膜的多重荧光共振能量转移（ multi-fluorescence resonance energy transfer，Multi-FRET）方法用于细胞表面特异性蛋白质棕榈酰化成像。在本研究中，叠氮棕榈酸（ azido-palmitic acid ，azido-PA）被代谢整合到细胞棕榈酰化蛋白中，经过点击化学反应偶联二苯并环辛炔修饰的Cy5（DBCO-Cy5）荧光基团。然后通过特异性的多肽识别将探针连接到目标蛋白上，从而启动杂交链扩增反应（hybridization chain reaction，HCR）。顺式膜标记方法保证了有效的分子内供体-受体距离，HCR扩增大大增加了供体荧光分子数目，从而提高了 FRET效率。该策略的优势在于实现了 PD-L1棕榈酰化的 FRET增强成像，而且在药物处理条件下精准检测PD-L1棕榈酰化水平的变化。此外，该方法成功实现了检测小鼠肿瘤中棕榈酰化的 PD-L1，为研究棕榈酰化对蛋白质结构和功能的影响提供了一个强有力的平台。
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