摘要
胰蛋白酶 （EC 3.4.21.4）是一种丝氨酸蛋白，能专一性切割肽链中精氨酸或赖氨酸残基，被广泛应用于皮革软化、食品加工、临床诊断和生化检测等领域。目前胰蛋白酶的商业生产主要依赖于从牛胰腺中提取，存在原料来源受限、分离纯化成本高以及免疫原性危害等问题。通过微生物生产胰蛋白酶具有方便快捷、成本低的特点，近年来受到广泛关注。论文通过基因挖掘得到了不同来源胰蛋白酶基因，在毕赤酵母Komagataella phaffii中异源表达后表征重组酶的酶学性质；在此基础上，对具有较优酶学性质的酶基因进行了前导肽改造、自降解位点的半理性改造以及发酵条件优化，最终显著提高了胰蛋白酶的表达量和催化活力。论文主要研究结果如下： （1）通过基因挖掘筛选得人（Homo spanies trypsin, HST）、牛（Bos taurus trypsin, BTT）、南极磷虾（Penaeus vannamei trypsin, PVT）和弗氏链霉菌（Streptomyces fradiae trypsin, SFT）来源的胰蛋白酶基因，并在 K. phaffii GS115实现了异源表达。对四种重组酶酶学性质进行了表征，发现 SFT的最适温度和最适 pH值分别为 45℃和 pH9，且在pH9-11具有更好的稳定性，说明SFT具有较温和的温度和碱性耐受能力，在碱性皮革软化过程中可能具有较好的应用价值。 （2）对弗氏链霉菌来源胰蛋白酶的前导肽改造，将融合标签 TrxA、非天然肽FVEF和牛源胰蛋白酶前肽VDDDK替换SFT初始前导肽，结果发现经前导肽修饰的改造酶aSFT的表达量（33.9 U·mL-1）和比酶活（20.6 U·mg-1）和初始酶相比分别提高了59.29%和40.29%。改造后的胰蛋白酶Km值为0.0715 mM，低于初始酶（0.0788 mM），说明前导肽的替换使胰蛋白酶底物亲和力有所提高。 （3）通过SFT结构中精氨酸与赖氨酸位点的溶剂可及性分析和保守氨基酸序列比对，推测了 5 个具有潜在自降解可能的氨基酸并构建了上述位点的丙氨酸突变体。结果发现，突变体 R124A、R135A、K295A 的酶活与野生酶相比有显著上升，其中R295A突变体的酶活达到39.39 U·mg-1，较WT提高了47.53%。此外，R295A、R315A和K333A突变体的自降解条带较少。 （4）摇瓶水平的发酵优化。最佳氮源为胰蛋白胨，浓度为 40 g·L-1；最佳无机盐源为CaCl2，浓度为2.5%；最佳发酵温度为30℃，最佳发酵pH为pH7，最佳接种量为1%，最佳装液量为30 mL。优化后发酵酶活可达92.8 U·mL-1，是未优化前的2.55倍。
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