摘要
慢性应激是多种疾病的主要病因或诱因，可导致机体生产性能下降、淘汰率与死亡率上升，对我国畜牧行业的健康发展造成不利影响。在现代集约化畜牧生产过程中，动物不可避免的会受到各种各样应激原的刺激，例如气候突变、长途运输、群体密度过高、兽医诊疗不规范等。慢性应激可导致前额叶皮质(Prefrontal cortex,PFC)组织损伤，诱发动物抑郁样行为，从而引起动物体重减轻、畜产品品质下降、病死率上升等一系列不利因素产生，造成一定的经济损失。因此探寻有效防治药物并阐明关键药效机制已经成为兽医学和医学领域的研究热点。相关研究表明，慢性应激可使脑中5-羟色胺(5-Hydroxytryptamine,5-HT)含量降低，随后抑制cAMP/CREB/BDNF通路传导，损害神经元的结构与功能。天然药物绿原酸(Chlorogenicacid,CGA)具有改善神经元丢失等较强的神经保护作用。然而，CGA是否对慢性应激诱导的PFC损伤具有保护效果及其作用机制尚不明确。因此本研究通过建立大鼠慢性束缚应激(Chronic restraint stress,CRS)模型，给予 CGA 干预，基于 cAMP/CREB/BDNF通路探究5-HT在CGA对慢性应激致大鼠PFC损伤的保护作用及其作用机制。 本试验选取70只健康的雄性Wistar大鼠，随机均分为7组(n=10):空白对照组(CON组)、慢性束缚应激组(CS组)、50mg/kgCGA干预组(CS+CAL组)、100 mg/kg CGA干预组(CS+CAM 组)、150 mg/kg CGA 干预组(CS+CAH 组)、100 mg/kg CGA 对照组(CON+CAM 组)以及 150 mg/kg CGA 对照组(CON+CAH 组)。每天 9:00～15:00 将大鼠固定在束缚器内共21d建立CRS模型。自造模开始，每天束缚前2 h,将CGA溶于生理盐水，按照每组不同剂量分别对大鼠进行灌胃，而CON组大鼠则置于鼠笼中不被打扰。每隔三天记录各组大鼠体重。21d应激程序结束后分别进行糖水偏好试验、旷场试验、悬尾试验及强迫游泳试验等行为学检测。行为学检测结束之后将所有大鼠通过异氟醚麻醉，心脏采血并处死，检测血清中皮质酮(Corticosterone,CORT)含量变化、观察大鼠PFC组织结构、检测5-HT含量变化、检测cAMP/CREB/BDNF通路变化以及IDO和SERT的变化。进而明确在慢性应激下，CGA对5-HT的调控机制及其对PFC保护作用机制。 试验结果:大鼠体重测量结果显示，与CON组相比，CS组大鼠体重显著下降(p＜0.001)、与CS组相比，CS+CAL、CS+CAM、CS+CAH组大鼠体重均有升高的趋势，但CS+CAM组上升显著（p＜0.01)。ELISA检测大鼠血清CORT含量结果显示，与CON组比较，CS组大鼠血清CORT含量显著上升(p＜0.01),与CS组相比，CS+CAM、CS+CAH组CORT含量显著下降(p＜0.01、p＜0.05)。行为学试验结果表明，与CON相比，CS组大鼠对糖水的偏好率显著下降(p＜0.001),对外界探索活动的总路程、跨格次数、站立次数以及中央区活动时间显著减少，在悬尾及强迫游泳中静止不动时间显著延长(p＜0.01),而100mg/kgCGA均改善了上述大鼠抑郁样行为。组织病理学结果显示，CON组、CON+CAH组和CS+CAM组大鼠PFC神经细胞结构完整，神经元胞浆内尼氏小体丰富。CS组、CS+CAL组和CS+CAH组出现大面积充血，神经元结构模糊，核仁消失，胶质细胞核固缩，尼氏小体消失。ELISA检测5-HT含量显示，与CON相比，CS组大鼠PFC中5-HT含量显著下降(p＜0.01),CS+CAM组大鼠5-HT含量较CS组显著升高（p＜0.05）。因此将采用100mg/kgCGA这一剂量用于后续的试验探究。此外，150 mg/kgCGA空白对照干预后对机体没有任何损伤，可见CGA具有高度的安全可靠性。PFC超显微结构观察结果显示，CON组和CS+CAM组神经突触结构完整清晰，间隙规则紧致。CS组突触数量相对明显减少，间隙界限模糊，前后膜发生融合。ELISA、Western blot、免疫组化和Real-time PCR检测cAMP/CREB/BDNF通路相关蛋白与基因结果显示，CS组中cAMP、PKA、p-CREB、BDNF表达水平明显低于CON组和CS+CAM组。Western blot、免疫组化及Real-time PCR检测IDO和SERT结果显示，CS组中IDO、SERT水平明显高于CON组和CS+CAM组。分子对接技术和CETSA结果显示，IDO和SERT与CGA结合紧密，表明可作为CGA的潜在的效用靶点。 综合各部分试验结果证明，CRS导致大鼠PFC中神经递质5-HT含量减少，从而抑制了cAMP/CREB/BDNF通路传导，降低神经细胞的营养及再生功能，造成大鼠PFC损伤继而对其产生抑郁样行为;CGA可通过作用于潜在靶点IDO和SERT直接或间接增加5-HT含量，促进cAMP/CREB/BDNF通路对CRS致大鼠PFC损伤发挥保护作用，从而改善大鼠抑郁样行为。
NETL