摘要
L-苹果酸在食品、化工和医药领域都有极其广泛的应用。细菌、酵母及丝状真菌等微生物已经用于发酵生产 L-苹果酸，而丝状真菌是最具 L-苹果酸生产能力的微生物，其中米曲霉（Aspergillus oryzae）是食品级安全菌株。然而，目前尚未实现A. oryzae大规模发酵生产L-苹果酸，其中一个主要的原因是其生长机制较为复杂，并且A. oryzae在发酵过程中产物的生成通常与其生长状态呈正相关。因此，强化A. oryzae的生长状态有利于最终代谢产物的生成。本研究通过对A. oryzae生长表型以及L-苹果酸生产能力之间的相关性进行深入解析，并借助实验室适应性进化的方法强化菌株生长状态，提高了菌株生产L-苹果酸的能力，主要研究结果和结论如下： 1. 确立了A. oryzae生长状态与L-苹果酸产量的关系：首先采用常压室温等离子体（ARTP）和氯化锂（LiCl）复合诱变的方式对出发菌株A. oryzae Z01进行诱变，构建了突变体库，筛选获得了L-苹果酸产量提高的突变株A. oryzae Z05，L-苹果酸的产量从49.7 g·L-1提升至74.6 g·L-1。其次，从菌落直径、菌落营养菌丝百分比（PVM值）和菌球数三个方面对出发菌株A. oryzae Z01和四株突变菌株A. oryzae Z02-Z05的生长状态进行比较，并结合其 L-苹果酸产量进行分析，最终建立了菌株生长状态与 L-苹果酸的数学计量关系，并确定了菌落直径26~30 mm、菌落PVM值35%~40%、菌球数220~240个·mL-1为L-苹果酸发酵的最佳生长状态范围。 2. 通过适应性进化获得了一株生长状态良好且L-苹果酸产量高的A. oryzae。首先，以诱变获得的突变菌株 A. oryzae Z05 为适应性进化的出发菌株，在以 2-苯乙醇为胁迫压力的环境中进行进化培养，最终得到进化菌株A. oryzae Z07。其次，对菌株A. oryzae Z07的生长状态进行参数表征，菌落直径为28.1 mm、菌落PVM值为39.1%、菌球数达到233个·mL-1，均处于最佳菌株生长范围。最后，将进化菌株A. oryzae Z07在7.5 L发酵罐中进行发酵培养，L-苹果酸产量、产率及生产强度分别为132.5 g·L-1、0.79 g·g-1及1.10 g·L-1·h-1，比出发菌株分别提高了63.99%、16.18%和64.18%。 3. 初步揭示了 A. oryzae 的生长机制。首先，从菌丝分支形成、分生孢子形成及菌球形成机制三个方面对 A. oryzae 生长机制进行了转录组学分析和形态表征。转录组学数据表明，MAPK信号路径和DNA合成路径是影响菌丝分支形成的关键，分生孢子的形成主要受中央调控路径和上游调控因子的影响，菌球的形成会受到钙离子信号和细胞壁（膜）合成路径的影响。其次，形态表征表明进化菌株A. oryzae Z07的菌丝分支化程度进一步提高，菌丝干重比出发菌株A. oryzae Z05提高了89.6%；分生孢子的发育也更加成熟，孢子更为密集，比出发菌株A. oryzae Z05孢子浓度提高了1.94倍；菌球内部的菌丝覆盖面积逐渐增大，进化菌株A. oryzae Z07的菌球内部菌丝覆盖率可达到90%。
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