摘要
降低眼内压是目前唯一被临床证实可以降低青光眼病变进展风险的有效治疗措施。青光眼滤过术的目的在于形成功能性滤过通道，从而保证房水排出通畅。手术成功主要取决于术后伤口愈合过程中的结膜纤维化程度和发生时间。若术后结膜损伤部位的Tenon’s囊成纤维细胞持续转化为肌成纤维细胞，细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）则会沉积硬化产生瘢痕，导致滤过泡消失、手术失败。Yes 相关蛋白（YAP）是成纤维细胞通过机械力途径活化和纤维化的关键力学信号，成纤维细胞可通过纤维化ECM中的机械信号和转化生长因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）共同调控 YAP，表达促纤维化蛋白，从而进一步引起成纤维细胞活化和 ECM 蛋白分泌，使瘢痕化加重。 目的：探究新型生物材料 RGD 多肽水凝胶，是否能通过抑制细胞机械力学信号YAP，从而减少Tenon’s囊成纤维细胞的活化以及ECM蛋白的分泌。 方法：体外实验：(1)通过合成0.5%、1%、2%浓度的自组装RGD多肽水凝胶，使用透射电子显微镜（TEM）观察内部微观结构，流变学检测机械性能。(2) 成功体外培养人胚胎 Tenon’s囊成纤维细胞（HFTF），利用人重组外源性 TGF-β2刺激 HFTF细胞活化，构建青光眼滤过术后瘢痕化的细胞模型；并使用 YAP 抑制剂维替泊芬作为阳性参考组。(3) 按照不同的处理因素，将 HFTF 细胞分为：①正常对照组：不作任特殊处理;②TGF-β2组：给予TGF-β2刺激；③实验组：TGF-β2刺激后，分别给予三个浓度的 RGD多肽水凝胶处理：0.5%、1%、2%；④阳性对照组： 在 TGF-β2刺激后，给予维替泊芬处理。(4) 通过蛋白质印迹实验（Western blot ，WB）、实时荧光定量 PCR （Quantitative Real-time PCR ，q-PCR）检测各组细胞中YAP及其下游因子结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor，CTGF CTGF）、细胞表型转化蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、ECM蛋白纤连蛋白（Fibronectin，FN）、I型胶原蛋白（Collagen I，Col I）的蛋白表达量及基因相对转录水平，并利用鬼笔环肽和细胞免疫荧光染色检测细胞骨架蛋白F-actin和YAP的表达定位。体内实验：(1) 20只7周龄雄性 SD大鼠平均分为单纯模型组、三个浓度 RGD多肽水凝胶实验组：构建鼠眼损伤模型后，分别于结膜下注射0.5%、1%、2%三个浓度的RGD多肽水凝胶，一周后对损伤部位切片进行Masson染色观察胶原纤维形态，免疫组化检测YAP、α-SMA的表达情况，最后将各结果进行统计分析。 结果：体外实验：(1) TEM结果表明，三个浓度的 RGD多肽水凝胶均可自组装形成纳米纤维网状结构，孔隙结构较为单一，但随着浓度增加，RGD 多肽水凝胶的交联更加密集；流变学结果表明，三个浓度的 RGD多肽水凝胶均为 G’≥G”，符合凝胶动力学特征，在交变应力作用下表现为动态粘弹性；杨氏模量随 RGD多肽浓度的增加而增加，分别约为 0.067 kPa、0.15kPa、2.17kPa。(2)WB和 q-PCR实验结果显示，TGF-β2诱导 HFTF细胞活化后，YAP、α-SMA、FN、Col I、CTGF的蛋白表达量及基因相对转录水平显著增加，实验组细胞中，采用不同浓度 RGD多肽水凝胶处理术后瘢痕化细胞模型后，YAP、α-SMA、FN、Col I、CTGF 蛋白表达量及基因相对转录水平与TGF-β2组相比均明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中 1%浓度的 RGD多肽水凝胶的抑制效应最佳，与YAP抑制剂维替泊芬组相当，差异无统计学意义。(3)细胞免疫荧光结果显示， HFTFs 被 TGF-β2 激活后形态呈星形，向四周伸出伪足， F-actin荧光信号增强，YAP 在细胞核中高表达；加入不同浓度水凝胶后，细胞伪足收回，F-actin荧光信号减弱，YAP逐渐位于细胞质表达，其中 1%浓度组可明显诱导 YAP向胞质转位； 维替泊芬可抑使YAP在细胞质中高表达，且减少了丝状应力纤维的产生。体内实验：(1) Masson染色：对单纯模型组相比，0.5%和 2%浓度组的胶原纤维增生面积较小，胶原之间排列疏松稍紊乱，胶原纤维颜色尚浅；而 1%浓度组的胶原纤维颜色稍深，胶原之间排列整齐连续，且新生胶原纤维量面积最小，与模型组的差异具有统计学意义（P＜0.05）。(2)免疫组化染色：与造模组相比，三个浓度RGD多肽水凝胶组的YAP、α-SMA的表达均具有不同程度的降低，1%浓度组最低（P＜0.05）。 结论：(1) 0.5%、1%、2%浓度的RGD多肽水凝胶均可自组装形成纳米纤维网状结构，且具有一定的机械性能，可以通过调节 RGD小分子多肽的浓度来模拟不同基质刚度的ECM。(2) TGF-β2可以诱导HFTF细胞的活化和ECM蛋白的合成，而不同浓度的RGD多肽水凝胶可以抑制HFTF细胞活化表型蛋白α-SMA的表达，减少机械信号YAP的表达及其在胞核内的积聚，并抑制下游靶基因CTGF的转录表达，还能下调ECM蛋白纤连蛋白（FN）、I型胶原蛋白（Col I）的表达，其中1%浓度的RGD多肽水凝胶的抑制效应最好。(3) 0.5%、1%、2%浓度的RGD多肽水凝胶在鼠眼损伤模型中均具有抗瘢痕的作用，可以减少胶原纤维的新生和沉积，以及YAP、α-SMA的表达，但1%浓度的作用最好。
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