摘要
目的：评价低、中、高剂量益气升阳固齿方对破骨细胞（Osteoclasts，OC）形成数量和骨吸收效应的影响，探索该处方对破骨细胞RANK、TRAF6、ERK通路的调控作用，探讨其抑制破骨细胞分化进程的作用机制。 方法：1.利用RANKL诱导RAW264.7细胞建立破骨细胞模型，用TRAP染色法鉴定模型是否建立成功；使用RANKL与益气升阳固齿方含药血清共同作用于RAW264.7细胞，分别用TRAP染色观察OC形成数量和甲苯胺蓝染色观察骨磨片骨陷窝数量和面积。 2.利用RANKL与益气升阳固齿方含药血清共同作用于RAW264.7细胞，用WB的方法检测RANK、TRAF6、ERK、p-ERK蛋白表达量，用RT-qPCR法检测RANK、TRAF6、ERK基因表达量。 3.利用RANKL与益气升阳固齿方含药血清和（或）ERK抑制剂（PD98059）共同作用于RAW264.7细胞，用WB检测ERK、p-ERK表达，运用流式细胞术检测细胞凋亡情况。 结果： 第一部分：1.利用RANKL诱导RAW264.7细胞建立体外破骨细胞模型，在经TRAP染色后棕红色沉淀，多核。2.TRAP染色结果显示：与Control组相比，其余各组均出现破骨样细胞，含药血清低、中、高剂量组均能明显降低破骨细胞数量（P＜0.05）；骨磨片实验结果显示：与Control组相比，其余各组均能形成骨吸收陷窝（P＜0.05）；与Model组相比，YL组减低骨陷窝面积有统计学意义（P＜0.05），YM组和YH组能同时减少骨吸收陷窝数目和面积。 第二部分：1.RANK蛋白：Model组RANK蛋白和基因表达明显升高（P＜0.001）；与Model比，YL、YM、YH组RANK蛋白表达均显著降低（P＜0.001）。2.TRAF6：与Control组比，Model组TRAF6蛋白和基因表达显著升高（P＜0.001）；与Model组比，含药血清干预后各组TRAF6蛋白和基因表达均显著降低（P＜0.001）。3.ERK:与Control组对比，Model组ERK蛋白和基因表达均无明显差异（P＞0.05）；与Model组比，YM、YH组ERK蛋白表达降低（P＜0.001）；与YL组比，YM、YH组ERK蛋白和基因表达均降低（P＜0.05）。4.p-ERK：与Control组比，Model组p-ERK蛋白和蛋白表达显著增加（P＜0.001）；与Model组比，YM、YH组p-ERK蛋白表达降低（P＜0.001）。 第三部分：1.加入通路抑制剂PD98059研究后实验结果：①ERK的WB：与Control组比，Model组及R+P组ERK表达没有统计学差异（P＞0.05）；与Model组比较R+Y组和R+P+Y组ERK蛋白表达量差异明显（P＜0.05）。②p-ERK的WB：与Model组相比，Control组、R+P组、R+Y组、R+P+Y组p-ERK蛋白表达量明显降低（P＜0.001）。2.流式细胞术检测结果显示：与Control组比，Model组早期凋亡率和晚期凋亡率均无明显差异（P＞0.05）；与Model组比，R+P、R+Y、R+P+Y组早期凋亡率和晚期凋亡率均不同程度增加（P＜0.05）；R+P+Y组较R+Y组与早期凋亡率增高，但差异无统计学意义（P＞0.05），晚期凋亡率增高（P＜0.05）。 结论： 1.益气升阳固齿方能有效抑制RAW264.7经RANKL诱导生成OC的数量和活性。 2.益气升阳固齿方能降低OC细胞中RANK、TRAF6、ERK的基因和蛋白表达水平，并且抑制ERK磷酸化。 3.益气升阳固齿方能通过抑制ERK磷酸化，促进OC的调亡，减少OC的数量和活性。
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