摘要
甲酸脱氢酶（Formate Dehydrogenase, FDH, EC 1.2.1.2）在构筑氧化还原生物合成体系方面具有众多优势，在发酵工业中常被应用于酶法辅因子再生系统。自然界约 80%的FDH为NAD+特异性，因此通过酶工程改造FDH的辅因子特异性并应用于NADPH再生系统具有一定的研究意义。巴斯德毕赤酵母（Komagataella phaffii, K. phaffii）具有利用甲醇的能力，其内源性FDH（FDH from K. phaffii, KphFDH）是典型的NAD+特异性 FDH，目前还没有对其进行辅因子特异性改造方面的研究。综上所述，本研究通过改造KphFDH的辅因子特异性以填补该研究方面的空白。 （1）本研究通过同源建模、结构分析、多序列比对的生物信息学方法和文献总结，将KphFDH的D195，Y196和Q197作为突变位点，确定了22种定点突变体组合。并构建了包括KphFDHWT在内的23个表达质粒，成功进行了蛋白表达纯化，蛋白纯度达95%以上。 （2）对纯化的KphFDH进行酶促反应动力学表征。结果表明KphFDHWT对NAD+的Km为0.088 mM，kcat为2.961 S-1，kcat/Km为33.648 mM-1·S-1，且无法催化NADP+还原。筛选到对NADP+特异性最高的突变体为KphFDHD195Q/Y196R/Q197H，其对NADP+的Km为 0.163 mM，kcat 为 1.306 S-1，kcat/Km 为 8.012 mM-1·S-1，催化特异性比率（(kcat/Km)NADP+/(kcat/Km)NAD+） 达 到 了 129.226。 以 NADP+为 辅 因 子 时 ， KphFDHD195Q/Y196R/Q197H对甲酸的催化效率仅为KphFDHWT以NAD+为辅因子时的4.2%。KphFDHD195Q/Y196R/Q197H催化NADP+还原的最适反应温度为45℃，最适反应pH为7.5，温度稳定性与KphFDHWT相似，但在碱性条件下的pH稳定性比KphFDHWT差。 （3）将 KphFDHD195Q/Y196R/Q197H与来自嗜热共生细菌的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体（Meso-diaminopimelate dehydrogenase from symbiobacterium thermophilum, StDAPDHH227V）应用于苯丙酮酸的还原胺化反应。苯丙酮酸浓度在105 min内呈线性下降，反应速率为 0.177 mM-1·min-1，在 150 min 内 20 mM 苯丙酮酸完全消耗。证明了KphFDHD195Q/Y196R/Q197H可以应用于体外NADPH再生系统。 （4）通过敲除maeB、zwf、sthA、maeA、pntAB和icd基因，构建了一株NADPH营养缺陷型大肠杆菌。将来自母牛分枝杆菌 N10 的 FDH 突变体（FDH from Mycobacterium vaccae N10, MvaFDH4M）作为验证工具，证明了FDH体内再生NADPH可以与该菌株的生长表型相偶联。但没有实现组成型表达 KphFDHD195Q/Y196R/Q197H以维持该菌株的甲酸依赖性生长。 综上所述，本研究筛选得到的 KphFDHD195Q/Y196R/Q197H为发酵工业中 NADPH 再生系统应用提供了一种选择，填补了 KphFDH 辅因子特异性改造方面的研究空白，为进一步改造其辅因子特异性提供了一种出发突变体，并为 K. phaffii的 NADPH辅因子工程提供了一种新的内源性工具酶。
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