摘要
瓜实蝇Zeugodacus cucurbitae(Coquillett)隶属双翅目实蝇科镞果实蝇属昆虫，是我国重要的检疫性害虫。瓜实蝇雌成虫产卵于瓜果内部，孵化后的幼虫由果实内部取食，影响果实产量和品质，给农业生产带来巨大的经济损失。阿维菌素因其高效、低毒以及杀虫谱广等特点，被广泛的应用于瓜实蝇的田间防治中。田间调查表明，瓜实蝇已对包括阿维菌素在内的多种杀虫剂产生了抗性且呈逐年上升的趋势。目前，有关于瓜实蝇抗药性方面的研究仅停留于抗药性监测上，其分子机制方面的研究未见报道。因此，开展瓜实蝇对阿维菌素的抗性机制研究，可为瓜实蝇田间抗药性的治理提供科学的理论基础。 本研究采用两种生测方法测定了17类30种杀虫剂对敏感品系（SS）瓜实蝇成虫的毒力并建立了相对敏感基线，同时采用建立的相对敏感基线，比较分析了2种生测方法对抗性品系（RS）抗性水平测定结果的差异；测定了阿维菌素处理4个时间段后SS和RS品系成虫体内GSTs谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione S-transferase,GSTs）和羧酸酯酶（carboxylesterase,CarE）酶活力，测定和比较两个品系GSTs、CarE酶动力学常数的变化及增效剂对阿维菌素的增效作用；以不同发育期的SS和RS品系瓜实蝇及其不同组织样本为试验材料，将8个候选内参基因通过RT-qPCR进行表达分析，并利用4个分析软件对基因表达稳定性结果进行综合评估，筛选出稳定表达的内参基因；利用RT-qPCR，鉴定了7个GSTs基因在SS品系瓜实蝇不同发育期和组织中的表达模式，比较了SS和RS品系瓜实蝇同一发育期和组织中7个GSTs基因的表达水平，并且鉴定了SS和RS品系成虫经LC50剂量阿维菌素诱导后12、24、48和72h其体内7个GSTs基因的表达模式。具体结果如下： （1）采用点滴法测得9类18种药剂LD50值在3.422ng·头-1~576.842ng·头-1之间；采用饲毒法测得10类21种药剂LC50值在0.035mg·L-1~60.542mg·L-1之间。两种方法测得的不同药剂对瓜实蝇毒力高低排序较一致，三种微生物源农药甲维盐、多杀霉素、阿维菌素和有机磷类乐果对瓜实蝇表现出较高的毒力，菊酯类、有机磷类和烟碱类等药剂次之，鱼藤酮毒力最低。点滴法和饲毒法测得的瓜实蝇RS品系的抗性倍数分别为18.22倍和17.37倍，较为接近。 （2）较SS品系相比，RS品系体内GSTs和CarE酶活均显著上升，分别为SS品系的2.92和1.46倍；LC25和LC50剂量浓度的阿维菌素处理后24-72h，SS和RS品系体内GSTs酶活均被诱导增强；LC25剂量阿维菌素处理后，SS品系内CarE酶活被诱导增强，而LC50剂量处理后CarE酶活受到抑制，RS品系中LC25和LC50剂量处理后各时段中CarE酶活均受到抑制；与SS品系相比，RS品系GSTs的Km显著减小，Vmax显著升高，CarE的Km和Vmax变化不明显；增效剂DEM和TPP和在SS品系中增效比分别为1.03和1.04，在RS品系中的增效比分别为3.45和2.52。以上结果表明，GSTs和CarE酶均在一定程度上参与了瓜实蝇对阿维菌素抗性形成的过程，其中GSTs酶活发生了量变和质变，其对底物亲和力增加和代谢速度增快，在瓜实蝇对阿维菌素抗药性形成中起到主导作用。 （3）geNorm分析结果显示，不同发育期处理组内参基因表达稳定性排序为：RSP13=RpL32(0.269)＞TUBE(0.623)＞TBP(0.702)＞β-Tubulin(1.069)＞G6PDH(1.366)＞Actin3(1.596)＞Actin2(1.923)；不同组织处理组内参基因表达稳定性排序为：RpL32=RSP13(0.132)＞TBP(0.345)＞TUBE(0.442)＞β-Tubulin(0.552)＞G6PDH(0.780)＞Actin2(1.101)＞Actin3(1.417)，最适内参基因个数为2。NormFinder分析结果显示，不同发育期处理组内参基因表达稳定性排序为：RpL32(0.399)＞RSP13(0.446)＞TUBE(0.738)＞G6PDH(0.912)＞TBP(0.924)＞β-Tubulin＞(1.086)＞Actin3(1.092)＞Actin2(1.866)；不同组织处理组内参基因表达稳定性排序为：RpL32(0.090)＞RSP13(0.117)＞TBP(0.389)＞TUBE(0.445)＞β-Tubulin(0.705)＞G6PDH(0.877)＞Actin2(1.009)＞Actin3(1.567)。BestKeeper分析结果显示，不同发育期处理组内参基因表达稳定性排序为：TUBE＞TBP＞RSP13＞RpL32＞β-Tubulin＞G6PDH＞Actin3＞Actin2；不同组织处理组内参基因表达稳定性排序为：β-Tubulin＞TBP＞RSP13＞RpL32＞TUBE＞G6PDH＞Actin2＞Actin3。RefFinder分析结果显示，不同发育期处理组内参基因表达稳定性排序为：RpL32＞RPS13＞TUBE＞TBP＞G6PDH＞β-Tubulin＞Actin3＞Actin2；不同组织处理组内参基因表达稳定性排序为RPS13＞RpL32＞TBP＞β-Tubulin＞TUBE＞G6PDH＞Actin2＞Actin3。综合分析结果表明，RpL32和RSP13可组合作为瓜实蝇不同发育期、不同组织和阿维菌素抗性分子机制及生理分子机制研究的内参基因。 （4）RT-qPCR分析结果表明，除个别样本外，在同一发育期和同一组织中，7个GSTs基因在RS品系中的表达水平显著高于SS品系；7个GSTs基因在SS品系不同发育时期和组织中的表达量存在差异，且每个GSTs基因的表达模式不同；经LC50剂量阿维菌素处理后12、24、48和72h，在SS和RS品系中除GST35外的6个GSTs基因均能被诱导表达且与对照组相比差异达到显著水平，且诱导后同一GSTs基因在SS和RS品系中的表达模式不同。以上结果表明，瓜实蝇阿维菌抗性的增强与体内7个GSTs基因的过表达有着密切的关系，且7个GSTs基因表达具有时间和空间特异性，推测7个GSTs基因具有解毒功能且GST37和GST38还具有其他生理功能，GSTs基因表达模式的改变增强了瓜实蝇对阿维菌素的耐受性。
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