摘要
研究目的： SARS-CoV-2引起的COVID-19自暴发以来，随着病毒的不断变异，其致病力减弱的同时感染性增强，加之我国疫情防控政策的全面放开，相对于如何防止感染，感染后的恢复变得尤为重要。传统中医经方小柴胡汤具有祛邪扶正，疏利三焦的作用，本课题组前期在全国名老中医白长川教授的指导下，以小柴胡汤为基础方，将人参改为党参，加用陈皮、黄芪、五味子、麦冬，全方配伍进行临床研究，结果证明了小柴胡汤加减方对COVID-19恢复期患者的免疫功能具有一定的改善作用，但是机制尚不明确。 因此，本研究首先通过网络药理学及分子对接技术预测小柴胡汤加减方治疗COVID-19的作用靶点及通路；再通过液相色谱-质谱联用仪技术鉴定小柴胡汤加减方含药血清的化学成分，分析复方药效物质基础；最后再通过细胞实验探究小柴胡汤加减方含药血清对肺部炎症、肺泡上皮细胞分化以及肺泡上皮细胞表面病毒靶点ACE2蛋白的作用，以验证小柴胡汤加减方对COVID-19恢复期肺部炎症损伤的抑制作用和修复作用，以及对病毒感染的预防作用。 研究方法： （一）基于网络药理学及分子对接技术预测小柴胡汤加减方治疗COVID-19作用靶点及通路的研究。 应用TCMSP、Uniprot数据库获取小柴胡汤加减方的有效成分与潜在靶点；应用GeneCards、OMIM数据库获取“Corona Virus Disease 2019”疾病的潜在靶点；应用R软件VennR脚本获取小柴胡汤加减方与COVID-19的交集基因。应用STRING数据库，获取蛋白互作网络图，应用R软件生成蛋白靶点频次图。应用Cytoscape 3.8.2获取小柴胡汤加减方治疗COVID-19的“药物—成分—靶点”及“药物—靶点—疾病”网络图；应用Network Analyze分析网络拓扑参数，以节点度值前5位为标准筛选出活性成分。应用R软件程序包获取GO富集和KEGG富集。应用AuTodock4软件将复方前两名活性成分与PPI网络前四名的靶点蛋白及ACE2蛋白结构进行分子对接，应用PyMol软件对结果进行可视化处理。 （二）基于液相色谱-质谱联用仪技术鉴定小柴胡汤加减方含药血清有效成分的研究。 称取小柴胡汤加减方药物，经煎煮与浓缩获得小柴胡汤加减方汤剂。SD大鼠分为两组，连续7日每日早晚分别灌胃汤剂和蒸馏水，经腹主动脉取血，静置、离心取上清液，灭活、过滤获得小柴胡汤加减方含药血清和空白含药血清。应用LC-MS技术检测小柴胡汤加减方含药血清的有效化学成分，同时结合文献检索，查阅化学成分的药理活性，分析药效物质基础。 （三）基于细胞实验研究小柴胡汤加减方含药血清对肺部炎症模型的作用。 1、确定小柴胡汤加减方含药血清干预细胞的最佳时间与浓度。A549细胞分组为control组和XCH组。首先选用5%体积分数的XCH含药血清分别处理A549细胞12h、24h、48h与72h，CCK-8测定细胞存活率。然后选用1%、2.5%、5%、10%体积分数的XCH含药血清处理A549细胞48h，CCK-8测定细胞存活率。 2、构建肺部炎症细胞模型。A549细胞分组为control组和LPS组。LPS组选用2.5mg/L和5mg/L浓度的LPS处理A549细胞48h。CCK-8测定细胞存活率，光学显微镜下观察细胞状态。 研究结果： （一）网络药理学及分子对接技术预测小柴胡汤加减方治疗的COVID-19的多靶点与多通路分析。 TCMSP、Uniprot数据库筛选出小柴胡汤加减方有效成分共152个，潜在靶点共312个；GeneCards、OMIM数据库筛选出COVID-19潜在靶点共2735个；R语言获取小柴胡汤加减方与COVID-19的交集靶点共132个。蛋白靶点频次图显示频次较高的核心蛋白靶点有AKT1、ALB、TNF、IL-6、TP53、IL-1β等，其中AKT1的相关性最大。Network Analyze分析网络拓扑参数，筛选出小柴胡汤加减方的主要活性成分由高到低依次为槲皮素、山奈酚、柚皮素、异鼠李素、β-谷甾醇等。GO富集分析共126个条目，富集较为集中的为细胞因子活性、细胞因子受体结合、DNA结合转录因子结合等；KEGG富集共169个条目，富集较集中的为糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、IL-17信号通路以及TNF信号通路等，以上相关通路均与AKT信号通路相关。分子对接显示AKT1、ALB、TNF与槲皮素、山奈酚均有较好的结合能力；槲皮素、山奈酚与ACE2均有较好的结合能力。 （二）液相色谱-质谱联用仪技术鉴定小柴胡汤加减方含药血清有效成分的分析。 LC-MS技术鉴定出小柴胡汤加减方含药血清共含有435种化学成分，其中，姜油酮、姜酚、核黄素、鲁斯可皂苷元、黄芩苷、大豆脑苷、β-谷甾醇、姜酮醇、姜黄醇、黄芪甲苷等化学成分的含量可能较高。柴胡含有的化学成分有136种，半夏有118种，党参有105种，陈皮有69种，生姜有153种，黄芩有92种，五味子有62种，麦冬有16种，大枣有121种，甘草有79种，其中有多种中药含有相同的化学成分。 （三）细胞实验探究小柴胡汤加减方含药血清对肺部炎症模型的作用。 1、小柴胡汤加减方含药血清最佳诱导时间为48h，最佳诱导浓度为5%体积分数。 CCK-8结果显示，5%体积分数XCH含药血清处理A549细胞12h、24h和72h时细胞存活率无变化，而48h对存活率具有显著的促进作用（P＜0.01）；CCK-8结果显示，1%、2.5%、5%与10%体积分数的XCH含药血清对A549细胞的存活率均有显著性促进作用，其中5%体积分数的XCH含药血清组细胞的存活率最高（P＜0.01）。 2、5mg/L浓度的LPS诱导A549细胞48h成功构建肺部炎症细胞模型。 CCK-8结果显示，2.5mg/L浓度的LPS对A549细胞的存活率无显著性差异，而5mg/L浓度对细胞存活率具有显著性的抑制作用（P＜0.05）；光学显微镜观察结果显示，5mg/L浓度的LPS对A549细胞的存活状态造成毒性损伤，40×视野中部分细胞成片脱落。 3、小柴胡汤加减方含药血清对肺部炎症细胞模型具有抑制作用。 CCK-8结果显示，LPS显著降低A549细胞存活率（P＜0.01），XCH与LPS共处理显著提高了A549细胞的存活率（P＜0.05）；光学显微镜下观察结果显示， 40×与200×视野中，LPS对A549细胞造成了毒性损伤，部分细胞呈成片脱落， XCH与LPS共处理挽救了LPS造成的毒性损伤，细胞贴壁较密集；qPCR结果显示，LPS诱导显著增加了A549细胞IL-1β与IL-6 mRNA的表达（P＜0.01），而XCH和LPS共处理抑制了细胞IL-1β（P＜0.05）与IL-6 （P＜0.01）mRNA的表达；WB结果显示，LPS上调了A549细胞AKT、NF-κB蛋白的表达（P＜0.05），， XCH与LPS共处理抑制了LPS诱导AKT蛋白（P＜0.05）、NF-κB蛋白（P＜0.01）表达的增加；IF结果显示，LPS诱导了NF-κB蛋白由胞质向核内的转移，而XCH和LPS共处理抑制了NF-κB的核转移现象。 4、小柴胡汤加减方含药血清对A549细胞表型Ⅱ型向Ⅰ型转化具有促进作用。 IF结果显示，XCH处理A549细胞下调了proSP-C蛋白的表达（P＜0.05），上调了AQP5蛋白的表达（P＜0.01）。 5、小柴胡汤加减方对A549细胞ACE2蛋白的表达具有抑制作用。 IF结果显示，XCH处理A549细胞下调了ACE2蛋白的表达（P＜0.01）。 研究结论： （一）网络药理学与分子对接技术预测小柴胡汤加减方发挥治疗COVID-19的主要活性成分以槲皮素、山奈酚等为主，其作用机制主要包括：（1）可能通过作用AKT信号通路，抑制IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8等炎症因子的表达，从而抑制COVID-19细胞因子风暴；（2）可能通过与ACE2蛋白的高度结合，从而抑制SARS-CoV-2的入侵进程。 （二）液相色谱-质谱联用技术鉴定小柴胡汤加减方含药血清共含有435种化学成分：（1）含量可能较高的化学成分具有抑制炎症反应或抑制病毒感染的作用，可能是小柴胡汤加减方发挥治疗作用的有效成分；（2）生姜、柴胡、大枣、半夏所含化学成分居多，可能是小柴胡汤加减方发挥治疗作用的主要中药组分。 （三）细胞实验研究表明小柴胡汤加减方对新型冠状病毒感染恢复期具有一定的作用，作用机制可能为：（1）小柴胡汤加减方含药血清可有效抑制LPS诱导A549细胞的肺部炎症反应，抑制细胞因子风暴，表现为抑制IL-1β与IL-6的表达，其机制可能与抑制AKT/NF-κB信号通路有关；（2）小柴胡汤加减方含药血清可有效促进A549细胞表型Ⅱ型向Ⅰ型的转化，可能对肺泡组织的修复具有一定的促进作用；（3）小柴胡汤加减方含药血清对A549细胞ACE2蛋白的表达具有抑制作用，可能对病毒的再次感染起到一定的预防作用。
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