摘要
米哚妥林是2017年FDA批准用于治疗急性髓性白血病的新药，其合成的关键中间体为星形孢菌素，由微生物发酵获得。目前国内外报道星形孢菌素产生菌的发酵单位偏低，生产成本偏高。本研究通过菌种诱变和抗性筛选获得星形孢菌素的高产菌株，再对电转化条件进行优化及其基因工程菌的构建，进一步提高菌株生产能力;最后，完成高产菌株的发酵和分离纯化工艺优化。 首先，利用UV和NTG等诱变技术结合星形孢菌素、链霉素、色氨酸和甲硫氨酸等抗性筛选的方法，对星形孢菌素产生菌SIPI-ST-23进行诱变和抗性筛选，得到一株较高产稳定的菌株，被命名为SIPI-ST-07。其摇瓶发酵单位达到503 mg/L,相对于 SIPI-ST-23 提高 191％。 其次，对SIPI-ST-07菌株进行电转化条件的优化及其基因工程菌的构建，以SIPI-ST-07菌株为出发菌株，通过对电转化的条件进行优化，获得最佳的电转化条件:甘油/甘露醇浓度比20∶1.5、甘氨酸浓度2 ％、电场强度9kV/cm、SIPI-ST-07菌丝体浓度150μL、质粒浓度1 μg、孵化时间6 h以及温度0～4℃,电转化效率从最初的4×106提高到9.6×108 CFU/μg DNA。采用PCR扩增获得相应的基因片段，通过同源重组构建重组质粒，筛选获得转化子。结果表明，获得了 pIB139-vgb、pIB139-fkbN、pSET152-staR、pSET152-staR-ermE*p、pSET152-staR-kasO*p 五种重组质粒，成功构建 SIPI-ST-A-1(pSET152)、SIPI-ST-B-17(pIB139-vgb)、SIPI-ST-C-6(pIB139-fkbN)、SIPI-ST-D-5(pSET152-staR)、SIPI-ST-E-9(pSET152-staR-ermE*p)和 SIPI-ST-H-23(pSET152-staR-kasO*p)等六种工程菌。 接着，对SIPI-ST-07菌株进行摇瓶发酵工艺优化，确定其最佳的碳源为葡萄糖和玉米淀粉组合，最佳氮源为棉籽饼粉、黄豆饼粉和酵母粉组合，无机盐离子为磷酸二氢铵、五水硫酸铜、七水硫酸镁和五水硫酸亚铁，并添加碳酸钙和泡敌。最佳发酵条件:摇床转速220 rpm、种子培养温度28℃、发酵温度28℃、一级种子接种量7％、初始pH 6.3、摇瓶装量30 mL、发酵周期5 d。通过对摇瓶发酵工艺优化，SIPI-ST-07菌株的发酵效价提高了 67％,达到835 mg/L。对优化后的发酵工艺用工程菌进行验证，其中工程菌SIPI-ST-H-23(pSET152-staR-kasO*p)的产量相比于菌株SIPI-ST-07提高了 17％,达到923 mg/L。 然后，对SIPI-ST-H-23进行5 L发酵罐的工艺研究，通过对接种量、葡萄糖补料和pH控制等因素优化。确定最佳的二级种子接种量为10％,发酵的后期还原糖维持在10～20 g/L,pH维持在6.5～6.9之间。高产菌株SIPI-ST-H-23在优化后5L发酵罐工艺条件下，星形孢菌素单位为1002mg/L,比原始工艺效价提升了 53％。 最后，对星形孢菌素分离纯化工艺进行研究，建立了星形孢菌素的最佳分离纯化工艺。将星形孢菌素发酵液调整pH至10～11,离心，菌渣烘干，粉碎。用乙酸丁酯提取3次，单步收率可达90.1％左右。对乙酸乙酯浸提液加入盐酸进行酸水相反萃取2次，单步收率可达86.1％左右，再对酸水相加入乙酸乙酯进行萃取2次，可得到纯度96.1％以上的星形孢菌素样品，单步收率可达80.1％左右。经过多批次实验验证，总收率在55％之上，HPLC检测星形孢菌素纯度在97％以上。 本研究构建米哚妥林合成中间体星形孢菌素的高产工程菌，建立了其发酵和纯化工艺，为产业化奠定了基础。
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