摘要
蟾酥，又称“蟾蜍眉脂”，是中华大蟾蜍(Buffo buffo gargarizans Cantor)以及黑眶蟾蜍(Buffo melanosticus Schneider)皮肤腺及耳后腺的干燥分泌物，是中国的传统动物药，可治“发背疔疮，一切恶肿”。研究表明蟾酥对各种恶性肿瘤均有治疗作用，其有效成分蟾毒配基类化合物更是应用广泛，如华蟾素、六神丸、麝香保心丹等。然而，随着外界因素的改变，蟾酥的可用资源愈发紧张。 目的： 筛选蟾酥中关键“毒—效”成分，解析蟾酥“毒—效”关联性，为蟾酥质量评价体系的合理建立提供理论依据，促进蟾酥资源的合理、充分使用;解析蟾蜍变态发育过程，为蟾蜍人工繁育、资源扩充提供研究基础;探究蟾毒配基类化合物生物合成调控途径，为蟾酥的资源可再生提供理论基础。 方法： 1.以正常斑马鱼作为蟾酥毒性评价动物，斑马鱼HepG2移植瘤模型作为蟾酥活性评价模型，对8批次来自不同地域蟾酥进行毒性和抗肿瘤活性评价。同时,利用UHPLC-Orbitrap-MS对8批次蟾酥进行检测，结合毒、活性评价结果利用正交偏最小二乘法判别分析法筛选蟾酥关键“毒—效”成分。选择代表性的毒、效成分展开调控研究，以阐述蟾酥的“毒—效”关联。 2.利用UHPLC-Orbitrap-MS和Illumina Novaseq测序技术对斑马鱼样本进行脂质组学和转录组学分析，筛选与蟾酥毒效相关的差异脂质和差异基因，根据检测结果阐明蟾酥毒效作用机制，结合实时荧光定量PCR技术对相关通路上关键蛋白的基因表达量进行验证。 3.对不同生长阶段的蝌蚪/幼蟾进行转录组、脂质组学分析，研究在亲本一致、生长条件相同的情况下，蝌蚪在变态过程中发生的机体变化。确定蝌蚪在变态发育过程中蟾毒配基类成分的变化趋势，结合转录组数据分析筛选潜在的蟾毒配基生物合成调控基因。 4.利用UHPLC-Orbitrap-MS对蟾蜍多组织进行检测，确定蟾毒配基类成分在蟾蜍体内的合成部位，并利用质谱成像、匀浆孵化实验加以验证，确定蟾毒配基类成分生物合成的关键器官。 5.对14只成年蟾蜍肝脏进行检测,利用加权基因共表达网络分析法和其它生物信息学分析手段识别潜在的蟾毒配基类化合物生物合成调控基因，根据富集分析结果确认重点关注的潜在调控基因，并在蝌蚪/幼蟾样本中进行实时荧光定量PCR检测，予以验证。 结果： 1.根据斑马鱼的评价结果，蟾酥具有明确的心血管毒性和抗肿瘤活性。UHPLC-Orbitrap-MS共检测到1365个有效分子离子，结合蟾酥毒、活性实验结果，利用正交偏最小二乘法判别分析法筛选8个蟾酥关键“毒—效”成分，分别为酯蟾毒配基、华蟾酥毒基、沙蟾毒精、蟾毒它灵、蟾毒灵、日蟾毒它灵、去乙酰华蟾毒精、远华蟾毒精。 2.利用斑马鱼对筛选到的蟾酥关键“毒—效”成分进行毒、活性评价和排序。毒性方面:蟾毒灵＞酯蟾毒配基＞远华蟾毒精＞华蟾酥毒基＞沙蟾毒精＞蟾毒它灵＞日蟾毒它灵＞去乙酰华蟾毒精。活性方面:在0.1μg·mL-1的治疗浓度下，去乙酰华蟾毒精＞酯蟾毒配基＞蟾毒它灵＞沙蟾毒精＞华蟾酥毒基＞远华蟾毒精＞日蟾毒它灵。 3.蟾酥可以通过调控钙离子信号通路和脂质代谢发挥“毒—效”作用。5μg·mL-1干预浓度下蟾毒灵、华蟾酥毒基上调Caveolin-2(CaV2)干扰细胞钙、钠等离子稳态，造成心率异常并引发细胞凋亡。蟾毒灵、华蟾酥毒基上调LPC等差异脂质促进抗炎介质释放，造成血流减缓甚至血栓形成。治疗浓度下(0.01～0.1 ng·mL-1),蟾毒灵和华蟾酥毒基对钙离子通道的激活作用不明显，但能够影响内质网中的钙存储，干预肿瘤细胞的能量代谢。三者的干预均能够对能量代谢、氨基酸代谢和差异脂质等物质产生回调作用。 4.在变态发育过程中，蝌蚪由于身体重塑以适应陆地生活，其饮食、能量代谢和脂质代谢均发生了显著变化，包括酮、脂肪生成、胆固醇代谢和脂肪酸氧化。并且发现了蟾蜍在变态发育过程中，蟾毒配基类化合物有蓄积趋势。转录组数据表明“磷酸戊糖途径”和“芳香化酶活性”可能是蟾毒配基生物合成的关键途径，并且提示CYP2家族对蟾毒配基的生成存在调控作用。 5.蟾蜍组织分布结果表明除耳后腺、皮肤组织外，蟾毒配基类化合物主要富集在蟾蜍胆囊中，因此推测肝脏能够生物合成蟾毒配基。DESI-MSI质谱成像仪器下的检测结果也指出，蟾毒配基主要富集在蟾蜍肝脏而非未发育成熟的耳后腺。蟾蜍肝脏匀浆孵化证明了蟾蜍肝脏能够独立生物合成蟾毒配基类化合物。 6.对14只成年蟾蜍肝脏进行转录组测序，筛选出潜在调控的蟾毒配基生物合成的差异基因。富集结果及蝌蚪/幼蟾样本中的实时荧光定量PCR检测表明胆汁酸、蟾毒配基的生物合成途径间修饰酶存在交集,且P450环氧化酶(CYP2C23,CYP2F4)可能参与了胆固醇C-17位的侧链环合为蟾毒配基类化合物六元不饱和内酯环的过程。 结论： 蟾酥具有明确的心血管毒性和抗肿瘤活性，蟾酥中的蟾毒灵、华蟾酥毒基可以通过调控钙离子信号通路和脂质代谢发挥关联性的“毒—效”作用。基于模式动物斑马鱼的评价模型，发现蟾毒灵、华蟾酥毒基和酯蟾毒配基毒性排序靠前,三者作为蟾酥的2020版《中国药典》质控指标，用药时应考虑限量;此外，蟾毒它灵、沙蟾毒精及去乙酰华蟾毒精的毒性弱，抗肿瘤活性却高于华蟾酥毒基,证明了 “唯含量论”的价值导向的不合理。更全面的质量评价方法有助于现有蟾酥的充分、有效、安全的使用。 中华大蟾蜍在变态发育过程中逐步建立化学防御，肝脏是蟾毒配基在体内合成的关键器官。胆固醇作为蟾毒配基生物合成的重要前体，“磷酸戊糖途径”为此过程提供了 NADPH;胆汁酸合成途径上的调控酶参与了蟾毒配基的合成调控,如HSD3B7等;P450环氧化酶(CYP2C23,CYP2F4)可能参与了胆固醇C-17位的侧链环合为蟾毒配基类化合物六元不饱和内酯环的过程。
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