摘要
α-葡萄糖苷酶抑制剂能够通过竞争性和可逆性抑制肠道α-葡萄糖苷酶，延缓碳水化合物的消化，从而降低对葡萄糖的吸收速率，缓解餐后血糖，广泛用于治疗Ⅱ型糖尿病。阿卡波糖（Acarbose）是首个用于临床的α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物，其卓越的疗效和安全性使它在市场上得到了普遍的认可。目前，游动放线菌（Actinoplanes sp.SE50）发酵生产，仍是获取阿卡波糖的主要方式。本研究在建立孔板发酵结合酶标仪检测的高效筛选方法的基础上，对阿卡波糖产生菌Actinoplanes sp.A01进行了多轮迭代常温室压等离子体（ARTP）诱变育种，使阿卡波糖产量显著提高，并对诱变前后菌株进行了非靶向代谢组学分析。本论文的主要研究现总结如下: （1）通过比较分析选择24孔板发酵代替传统的摇瓶发酵，并对孔板发酵条件进行了优化。结果表明，平板菌落直接转接至24孔板发酵法采用的培养基中黄豆饼粉、甘油、碳酸钙三种成分的添加量在原始发酵培养基上分别改为3％、1.5％和0.4％时，阿卡波糖的发酵水平最佳，相对于未优化培养基，阿卡波糖产量提高了 25.2％。孔板发酵168 h时，阿卡波糖产量达到最高，达到了 2064.61 μg/mL,故以168 h作为最佳发酵时长。将孔板发酵与酶标仪检测方法相结合，构建了游动放线菌产阿卡波糖高通量筛选模型。 (2)游动放线菌ARTP诱变选育阿卡波糖高产菌株。根据前期预实验确定了 ARTP诱变最佳处理时长120 s,链霉素抗性板最佳初筛浓度0.1 μg/mL。经迭代诱变最终筛选得到一株阿卡波糖高产菌株Actinoplanes sp.AH-02,其摇瓶发酵产量达到 3901.50 μg/mL,相比出发菌株(2364.96 μg/mL)阿卡波糖产量提高了 64.97％。对出发菌株和高产突变菌AH-02发酵过程中pH、菌浓及阿卡波糖产量三项参数进行考察，得出获得阿卡波糖的最佳发酵周期为168 h,延长发酵时间阿卡波糖产量开始下降。对高产突变株Actinoplanes sp.AH-02进行遗传稳定性考察，结果表明，其在传代三次以内，基本维持稳定，在10％范围内变化，传代到第四代，开始明显退化。 (3)对高产突变株 Actinoplanes sp.AH-02与原始菌株Actinoplanes sp.A01进行非靶向代谢组学分析发现。在正负离子模式下分别筛选出216种和161种差异代谢物，说明ARTP诱变选育具有不确定性，不仅能够增强阿卡波糖的合成，同时也会改变其他代谢产物的积累。差异代谢物种类主要分为有机酸及其衍生物、脂质和类脂质分子、有机氧化合物、有机氮化合物、核苷、核苷酸和类似物、苯丙烷和聚酮等。其中包含的差异代谢物不仅有阿卡波糖，还存在葡萄糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、松三糖、果糖、组氨酸、谷氨酸、赖氨酸、脯氨酸等。通过阿卡波糖代谢合成途径中的代谢物分析，发现糖酵解途径(EMP)、磷酸戊糖途径、ABC转运蛋白代谢途径及柠檬酸循环(TCA)等代谢途径中的代谢物均发生显著变化。其中柠檬酸循环、组氨酸代谢、谷氨酸族氨基酸代谢等阿卡波糖生物合成的支路途径有明显上调趋势，说明阿卡波糖合成代谢过程，存在一部分碳代谢流流向柠檬酸循环，使得柠檬酸循环中间体α-酮戊二酸水平增加，促进谷氨酸等氨基酸的合成，进而竞争阿卡波糖合成碳代谢流，不利于阿卡波糖的发酵生产。非靶向代谢组分析在代谢层面上解析了高产突变菌株Actinoplanes sp.AH-02高产阿卡波糖的代谢网络，为后续代谢工程改造构建高产阿卡波糖工程菌株提供了研究思路和方向。 (4)基于CRISPR/Cas9技术，构建基因工程菌株Actinoplanes sp.AH-△melC2-acbS。从游动放线菌全基因组扩增得到阿卡波糖合成基因簇中糖基转移酶编码基因acbS和酪氨酸酶基因melC2上下游的的目的片段，利用pCRISPomyces-2质粒与强启动子PKasOp*、acbS、melC2 上下游片段，构建重组质粒 pCRISPomyces-2-△melC2∷PKasOp*-acbS,并将其导入游动放线菌Actinoplanessp.AH-02,实现了酪氨酸酶基因melC2的敲除和糖基转移酶acbS的整合。对重组菌株Actinoplanes sp.AH-△melC2-acbS进行摇瓶验证，其阿卡波糖产量达到 4867.21 μg/mL,比 Actinoplanes sp.AH-02 发酵产量提高了 22.99％,比原始菌株Actinoplanessp.A01阿卡波糖产量提高104.07％。
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