摘要
目的： 为了探讨新疆老年人阿尔茨海默病（AD）及轻度认知功能障碍（MCI）患者血浆中潜在的生物标志物，本研究通过高通量测序分析差异基因表达谱，筛选出差异表达的1ncRNA基因位点，并在人群中验证差异基因的表达情况；通过构建AD细胞模型，探讨LncRNAAL133415.1对预测靶基因Vimentin（VIM）的调控作用和机制。 方法： 第一部分：根据病例组和对照组年龄相近的原则选取AD患者5例，MCI患者5例，对照5例为研究对象，收集研究对象的血液标本，提取RNA，采用高通量的测序方法对研究标本进行全转录组测序，结合GO和KEGG富集分析等生物信息学分析方法，筛选AD、MCI患者中差异表达的1ncRNA、mRNA的表达谱及基因位点，预测差异表达的1ncRNA调控的靶基因及生物学功能。第二部分：根据第一部分筛选的1ncRNA基因位点，结合文献报告的相关1ncRNA基因位点，确定候选1ncRNA基因位点。分别在40例AD人群，40例MCI，40例对照人群中，使用实时荧光定量PCR的方法进行人群表达情况的验证；分析基因表达情况与临床基线资料之间的相关性；通过受试者工作特征（ROC）曲线建立疾病的诊断模型，探讨差异基因位点对疾病诊断的价值。第三部分：通过基于表达量相关性的共表达分析的生物信息学分析方法，预测LncRNAAL133415.1作用的靶基因VIM。通过体外细胞实验，选用Aβ1-42诱导SH-SY5Y细胞来构建阿尔茨海默病细胞模型，采用分子克隆、qRT-PCR、Western blot技术、细胞转染、质粒构建等技术，探索LncRNAAL133415.1对VIM基因表达调控的机制的影响。 结果： （1）?差异基因位点筛选结果显示：AD组共有1013个差异表达基因，其中上调的有514个，下调的有499个。上调倍数最大的是MSTRG.13771.2基因，下调倍数最大的是MSTRG.3939.4基因。在mRNA数据中，共筛选出447个差异的表达基因，其中上调的有206个，下调的有241个。上调倍数最大的是MKL2基因，下调倍数最大的是ENST00000652454基因。MCI组共有874个差异表达基因，其中上调的有413个，下调的有461个。上调倍数最大的是MSTRG.5005.3基因，下调倍数最大的MSTRG.12118.6基因。在mRNA数据中，共筛选出4813个差异的表达基因，其中上调的有2307个，下调的有2506个。上调倍数最大的是MKL2基因，下调倍数最大的是SCFD2基因；?通过GO富集分析和KEGG通路分析，在AD组中共筛选出了6个差异的LncRNA位点，分别为ENST00000654948、ASMTL-AS1、AC005730.3、AP001363.1、AL133415.1、AC020916.1。在MCI组共筛选出了4个差异的LncRNA位点，分别为AP003068.2，AL355075.4，ENST00000668018，AC008750.2；?差异基因功能富集分析结果数据显示，差异基因参与的生物学过程主要包括：神经系统发育等。在细胞定位中主要涉及神经元棘、神经元胞体、神经元之间的突触、树突棘头、轴突部分等。分子功能中包括ATP结合、氧化还原酶活性、脑源性神经营养因子结合等。KEGG富集分析发现，差异基因可能参与的信号通路包括：阿尔茨海默病、炎症介质对色氨酸通道的调节等。 （2）?对AD组中6个差异的LncRNA位点（ENST00000654948、ASMTL-AS1、AC005730.3、AP001363.1、AL133415.1、AC020916.1）在80个独立样本中进行了验证，发现AD组的表达远低于对照组，差异均有统计学意义（Z=-4.061，P＜0.001；Z=-2.054，P=0.039；Z=-2.723，P=0.006；Z=-6.197，P＜0.001；Z=-3.416，P＜0.001， Z=-4.176，P＜0.001）；在MCI组发现LncRNA AL355075.4、AP003068.2表达均高于对照组，差异具有统计学意义（Z=-2.261，P=0.023，Z=-2.312，P=0.020）；?采用ROC曲线评价外周血中LncRNA基因位点（ENST00000654948、ASMTL-AS1、AC005730.3、AP001363.1、AL133415.1、AC020916.1）相对表达量对AD诊断的价值。通过绘制受试者工作曲线发现，AL133415.1（AUC=0.635，95%CI：0.507-0.763， P=0.036）、ASMTL-AS1（AUC=0.658，95%CI：0.513-0.785，P=0.015）、AC005730.3 （AUC=0.627，95%CI：0.498-0.756，P=0.049）、AP001363.1（AUC=0.708，95%CI：0.595-0.822，P=0.001）基因ROC曲线下的面积差异具有统计学意义，而AC020916.1和ENST00000654948基因ROC曲线下的面积未见统计学差异。在MCI组发现， AL355075.4（AUC=0.729，95%CI：0.616-0.837，P＜0.001）、AP003068.2（AUC=0.696， 95%CI：0.583-0.810，P=0.002）基因ROC曲线下的面积差异有统计学意义。 （3）通过构建AD体外细胞模型实验，使用CCK-8法检测各组的细胞活性，发现 LncRNAAL133415.1 抑制组与对照组相比，能够提高细胞活性，而LncRNAAL133415.1过表达组与对照组相比能够降低细胞的活性，差异均有统计学意义（t=-0.65, P=0.005；t=0.074，P=0.001）。miR-138-5p抑制组相比于对照组能够增加细胞活性，而miR-138-5p过表达组则会抑制细胞的活性，差异均有统计学意义（t=-0.118，P＜0.001；t=-0.141，P＜0.001）。 检测各组细胞的凋亡率发现，LncRNAAL133415.1抑制组相比于对照组能够降低细胞凋亡率，而LncRNAAL133415.1过表达组与对照组相比能够增加细胞凋亡率，但未见有统计学差异。LncRNA AL133415.1抑制组和过表达组与空白对照组相比均能增加细胞凋亡（x2=9.280，P=0.002；x2=24.175，P＜0.001）。miR-138-5p抑制组和过表达组与空白对照组相比均能增加细胞凋亡（x2=5.555 ， P=0.018；x2=30.86 ， P＜0.001），而miR-138-5p过表达组与对照组比较则促进细胞凋亡率，差异有统计学意义（x2=5.40，P=0.02）。检测各组细胞氧化应激指标发现，LncRNAAL133415.1和miR-138-5p的表达下调可以增加细胞内SOD活性，表达上调则会降低细胞内SOD的活性。LncRNA AL133415.1和miR-138-5p表达下调均可以导致细胞内MDA、ROS活性下降，而表达上调均可以导致细胞MDA、ROS活性上升。 在mRNA水平和蛋白水平分析发现，LncRNAAL133415.1抑制组的VIM表达高于对照组和Aβ1-42组，差异有统计学意义（t=-0.187，P＜0.001；t=0.159，P＜0.001）。而在LncRNAAL133415.1过表达组发现，VIM表达低于对照组和Aβ1-42组，差异有统计学意义（t=0.141，P＜0.001；t=-0.165，P＜0.001）。抑制MiR-138-5p表达后， VIM表达高于对照组和Aβ1-42组，差异有统计学意义（t=-0.337，P＜0.001；t=-0.350， P＜0.001）。而在MiR-138-5p过表达组发现，VIM表达明显低于对照组和Aβ1-42组，差异有统计学意义（t=-0.288，P＜0.001；t=-0.828，P＜0.001）。 结论： （1）本研究共筛选出10个差异的LncRNA基因位点，其中AD组6个，MCI组4个，这些基因位点可能是疾病潜在的生物标志物。AD组差异基因主要参与神经元、突触、轴突、微管细胞骨架生物学等功能，参与的主要信号通路为阿尔茨海默病等；MCI组差异基因主要参与中枢神经系统发育、神经元分化、神经冲动传导的调节生物学等功能，参与的主要信号通路为轴突引导等。 （2）AD组的6个差异的基因位点表达远低于对照组，MCI组的2个差异的基因位点表达均高于对照组，这说明差异基因位点在AD组低表达，而在MCI组中差异基因高表达。 （3）通过绘制ROC曲线发现，在AD组中AL133415.1、ASMTL-AS1基因、AC005730.3基因、AP001363.1基因对疾病的诊断有预测的价值。在MCI组发现， AL355075.4、AP003068.2基因对疾病的诊断有预测价值。提示以上位点可以作为疾病早期诊断潜在的生物标志物，用于AD、MCI的早期诊断的预测。 （4）LncRNAAL133415.1和miR-138-5p沉默可以促进VIM的表达，而过表达的LncRNAAL133415.1和miR-138-5p可以抑制VIM的表达，VIM可以增加细胞内淀粉样蛋白的产生，而淀粉样蛋白是AD的致病危险因素，因此提示可以通过调控LncRNAAL133415.1和miR-138-5p间接调控VIM的表达，从而降低AD的发病。
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