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肿瘤酸性微环境和MMP双响应Gelonin功能蛋白的生物合成及抗肿瘤活性评价
曹卉艳1
作者信息
摘要
核糖体失活蛋白（RIPs）可以通过其N-糖苷酶活性使核糖体失活，进而通过抑制蛋白质的合成来发挥抗肿瘤效应。Gelonin 是一种来源于大戟科植物何首乌（Gelonium multiflorum）、分子量为29 kD蛋白质。它属于I型RIPs，具有N-糖苷酶活性，能够切割28S rRNA使核糖体失活，导致细胞死亡，是一种高效抗肿瘤蛋白。但Gelonin缺乏细胞结合结构域，难以内化进入肿瘤细胞，使其应用受到很大限制。为解决这一问题，基于肿瘤酸性微环境及高表达MMP-2/9的特征，本课题设计了一种植物毒素Gelonin的功能蛋白Trx-PVGLIG-pHLIP-Gelonin（TPpG。其中，Trx可以提高融合蛋白水溶性；PVGLIG肽可以被MMP-2/9（在多种肿瘤组织中高表达）特异性切割使pHLIP暴露出来；pHLIP可以响应肿瘤的弱酸环境将Gelonin递送至肿瘤细胞内；Gelonin可以发挥高效抗肿瘤活性。本研究通过原核表达成功获得了TPpG蛋白，并对其细胞内化情况以及体外抗肿瘤作用进行了研究。本论文包含以下三部分研究内容： （1）我们通过全质粒PCR成功构建了重组质粒pET32a-PVGLIG-pHLIP-Gelonin，通过原核表达系统成功获得融合蛋白TPpG，并通过镍离子亲和层析对得到的TPpG进行了纯化。通过SDS-PAGE、Western Blot和质谱对TPpG进行了表征，证明TPpG表达成功。使用圆二色谱检测了TPpG蛋白的二级结构和热稳定性，同时测定了TPpG蛋白的血清稳定性，结果表明TPpG蛋白具有较好的热稳定性以及良好的pH和血清稳定性。 （2）为了检测功能蛋白的细胞内化行为，利用FITC对TPpG和Gelonin进行了标记，紫外可见分光光度计证实我们成功获得了FITC-TPpG和FITC-Gelonin。通过激光扫描共聚焦显微镜、流式细胞术以及Western Blot三种不同的方式对TPpG的内化行为进行了检测。结果表明，与低表达MMP-2的MCF-7细胞相比，在弱酸性条件下，TPpG可以更显著地进入高表达MMP-2的HT1080细胞内。 （3）采用低表达MMP-2的MCF-7细胞和高表达MMP-2的HT1080细胞为研究对象，通过多种方法检测了TPpG的体外抗肿瘤活性。首先通过MTT法、SRB法、结晶紫染色法及CFDA-SE染色法检测了TPpG对肿瘤细胞增殖的抑制作用；接着通过Annexin V-FITC/PI双染法和Caspase-3活性检测试剂盒测定了TPpG对细胞凋亡的诱导作用；最后通过BCA法测定了TPpG处理后细胞内总蛋白水平。结果证明：在弱酸性条件下，TPpG可有效抑制肿瘤细胞增殖，使得凋亡细胞比例显著增加， Caspase-3的相对活力上升，并抑制胞内蛋白质合成。以上现象在高表达MMP-2的HT1080细胞中更加明显。 总之，我们首次设计并通过原核表达系统获得了对肿瘤酸度和MMP双响应的植物毒素Gelonin功能蛋白TPpG，并较为系统地研究了其体外抗肿瘤活性。TPpG可介导Gelonin以MMP和pH双响应的方式有效内化进入肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞增殖、诱导其发生细胞凋亡并抑制胞内蛋白质合成，进而高效杀死肿瘤细胞。本研究可为Gelonin的生物应用奠定新的理论基础，并可为蛋白质等大分子药物的靶向递送提供一种通用且高效的新策略。
关键词
植物毒素Gelonin/功能蛋白/生物合成/肿瘤酸性微环境/基质金属蛋白酶/生理响应/抗肿瘤活性引用本文复制引用
授予学位
硕士学科专业
生物化学与分子生物学导师
丁国斌学位年度
2023学位授予单位
山西大学语种
中文中图分类号
R2