摘要
太白贝母（Fritillaria taipaiensis P.Y.Li）是中药川贝母基源物种中最适宜在低海拔种植的物种，以种子栽培为主。太白贝母种子属于形态生理休眠类型，从播种到萌发都需要经历较长的休眠时间，这个特性是其栽培和驯化的主要障碍之一。目前关于太白贝母种子的研究多集中在施加外源处理、考察最适生长温度以及沙藏条件等方面，其种子萌发前的胚胎学变化及其分子调控的研究鲜为人知。为了了解太白贝母种子萌发前的生长变化，进一步探索休眠解除的原因，本研究将形态解剖学技术与转录组技术联合起来，旨在通过形态学和解剖学技术观察太白贝母种子休眠期间的发育变化，从胚胎发育的角度探讨了种子休眠期长的原因。借助连续石蜡切片技术，从细胞组织学角度研究休眠期胚胎器官发生的过程。在此基础上，从转录组学层面研究分析太白贝母种子在不同发育阶段的基因上下调变化，挖掘可能调控太白贝母种子形态后熟的关键基因,为贝母属种子的休眠解除机制提供分子研究基础。本研究取得的主要结果如下: （1）经过连续石蜡切片观察，证实太白贝母种子休眠期较长主要是由形态后熟造成，其形态休眠过程可以按照器官分化情况划分为原胚期、胚芽原基期、胚根期、子叶期;其中，原胚发育完成需要较长时间，这是种子形态发育时间较长的主要原因。 （2）在原有的研究基础上，对太白贝母种子进行0、30、50、70、100mg/L赤霉素预处理，发现70mg/L的赤霉素更适宜太白贝母种子的生长，经过较高浓度赤霉素预处理的种子发霉率较高，较低浓度的赤霉素预处理对种子无明显作用。 （3）将自然条件下生长的原胚期（B1）、胚芽原基期（B2）、胚根期（B3）、子叶期（B4）的种子，以及70mg/L赤霉素处理后的胚芽原基期（T2）、胚根期（T3）、子叶期（T4）进行转录组测序，获得Unigene 92502条。以B1为参照组，获得 B2 vs B1、B3 vs B1、B4 vs B1、T2 vs B1、T3 vs B1、T4 vs B1 六个比较组中的差异表达基因，分别为3696、4508、1540、2744、1259、3316。WGCNA分析获得24个共表达模块，以相关性度量值大于0.6或r＞0.2,r值的总和＞0.8为筛选依据，获得7个特异富集模块。将差异表达基因进行GO和KEGG富集后分析发现:太白贝母种子在萌发前主要有许多胁迫响应基因参与表达。通过分析空白组的植物信号转导通路与淀粉与蔗糖代谢通路，筛选得到10个主要参与生长素、脱落酸、赤霉素、茉莉酸、油菜素内酯、细胞分裂素及水杨酸等激素合成途径的差异共表达基因，在淀粉与蔗糖代谢通路中筛选获得12的差异共表达基因。其中KAN2和WAXY作为空白组和处理组差异共表达基因，高度参与种子发育过程。 外源赤霉素的处理可以显著激活太白贝母种子内部的细胞分裂素应答、细菌防御反应、脱落酸反应，且通过结合WGCNA结果发现，细菌防御机制相关基因的丰富表达在种子发育后期。进一步分析发现外源赤霉素处理以后的种子内部KAO、GA20ox、GA3ox、CPS表达增加，GA2ox以及ABI5的表达降低，从而促进种子内部代谢、响应种子防御机制，增强种子防御能力从而提高种胚发育速度，缓解太白贝母种子的休眠程度。此外，可以弱化IAA敏感性的GH3.5丰富存在于原胚期，或许是导致原胚发育缓慢的原因之一，而赤霉素处理后丰富表达的乙烯转录因子1(PIT5)可能是促进原胚发育进程的相关基因。 在本次转录本中获得56个转录因子家族参与太白贝母种子发育，其中，WRKY、MYB、bZIP、ARF等TFs家族参与种子内的物质和激素代谢。这些基因丰富表达在太白贝母种子各个发育阶段，对太白贝母种子发育具有重要作用,可作为候选基因进行深入研究。
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