摘要
干扰素（Interferon, IFN）是机体在病毒感染时诱导产生的一种细胞因子，在天然免疫中发挥重要作用。目前可分为三类，包括Ⅰ型干扰素、Ⅱ型干扰素、Ⅲ型干扰素。其中Ⅲ型干扰素（IFNλs）主要在宿主黏膜细胞发挥重要作用。目前在猪、猴、鼠等许多物种中均发现IFNλs及其亚型，但鸡IFNλs（chIFNλ）报道较少，仅发现了chIFN-λ3。本实验室前期在进行chIFN-λ的研究过程中，发现了一种新的鸡源Ⅲ型干扰素剪接体chIFN-λ3a。本研究在此基础上，通过瞬时过表达对其活性进行初步验证，利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统进行表达和纯化，开展其抗病毒活性研究，以期为chIFN-λ3a的抗病毒机制研究与临床应用奠定坚实基础。具体方法和结果如下： （1）chIFN-λ3a真核质粒构建、表达和抗病毒效果评价 基于前期获得的chIFN-λ3a基因，将其亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1中，获得重组质粒pcDNA3.1-chIFN-λ3a，同时用同样的方法构建pcDNA3.1-chIFN-λ3作为对照。酶切与测序鉴定正确后，将质粒通过脂质体转染法转染至DF-1细胞中进行表达验证，Western blot检测表明chIFN-λ3a和chIFN-λ3成功表达。在此基础上，利用病毒感染实验分析chIFN-λ3a对VSV-GFP病毒的抑制效果，结果表明，瞬时表达chIFN-λ3a和chIFN-λ3均可以抑制VSV-GFP病毒在DF-1细胞中的增殖。 （2）chIFN-λ3a在重组杆状病毒中的表达和鉴定 为探究不同杆状病毒表达载体的表达能力，选择三种载体pFastBac1、pFastBac-Dual、pFastBac-DN（为本实验室改造），在chIFN-λ3a基因3’端添加Strep标签后，进行昆虫细胞密码子优化并合成，通过双酶切分别与三种载体连接，获得三种重组穿梭质粒，经蓝白斑筛选后，挑取转座成功的重组杆粒，PCR验证正确后，转染至SF-9细胞中并通过Western blot检测目的蛋白表达。结果表明，三种载体均能成功表达目的蛋白，经不同接毒量和不同时间条件的筛选，pFastBac1作为载体目的蛋白表达量最高，因此，确定以该载体作为目的蛋白表达的最佳载体。 （3）重组chIFN-λ3a的纯化及抗病毒效果评价 以实验（2）确定的最佳载体进行目的蛋白的大量表达，利用Strep亲和层析柱进行纯化，获得chIFN-λ3a，纯度为42%。纯化后的chIFN-λ3a进行干扰素活性测定后，孵育DF-1细胞，12 h后感染VSV-GFP（Vesicular Stomatitis Virus-GFP）病毒（0.01 MOI），通过荧光观察法、流式细胞术、结晶紫染色进行chIFN-λ3a抗病毒活性分析。接种H9N2亚型禽流感病毒（5 MOI）进行抗病毒活性验证。结果显示chIFN-λ3a可抑制VSV-GFP、H9N2亚型禽流感病毒增殖，表明利用重组杆状病毒-昆虫系统成功表达了chIFN-λ3a，且具有抗病毒活性。
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